Лабораторная работа №6. Обнаружение фенобарбитала в биологическом материале

Фенобарбитал (люминал)- белый кристаллический порошок слабогорького вкуса, растворяется в этиловом спирте (1: 15), хлороформе (1: 50), в растворах щелочей, слабо растворяется в воде (1: 1000). Фенобарбитал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Фенобарбитал оказывает снотворное, успокаивающее и противосудорожное действие. Он применяется для лечения эпилепсии, хореи и других заболеваний. В малых дозах фенобарбитал применяется при начальных стадиях гипертонической болезни, стенокардии и др. Фенобарбитал, по сравнению с другими барбитуратами, относительно медленно всасывается из пищевого канала и имеет продолжительное действие.

Фенобарбитал метаболизируется несколькими путями. Основными метаболитами фенобарбитала являются 5-этил-5-/г-гидроксифенилбарбитуровая кислота, г-оксифенилбар-битал. Эти метаболиты частично выделяются с мочой в виде глю-куронидов. Некоторое количество фенобарбитала превращается в о-оксифенобарбитал. Обнаружены еще 3 метаболита фенобарбитала, состав которых не изучен. Часть принятой дозы фенобарбитала выделяется с мочой в неизмененном виде.

Обнаружение фенобарбитала в биологическом материале по реакции с солями кобальта и щелочами.

Фенобарбитал с солями кобальта и щелочью дает розовую или красную окраску.

Цвиккер (1931) установил, что от прибавления хлорида кобальта и гидроксида бария к барбитуратам образуется окрашенное соединение. В 1932 г. Цвиккер вместо гидроксида бария применил гидроксид калия. Другие исследователи вместо гидроксида бария применяли гидроксид лития.

Реактивы и оборудование.

Водный раствор исследуемого вещества, этиловый спирт, 1 %-го раствор ацетата кобальта, 1 %-го раствор гидроксида калия, пробирки, пипетки, груши.

Ход работы.

Исследуемое вещество или остаток, полученный после выпаривания вытяжек из соответствующих объектов, растворяют в 0,2—0,5 мл абсолютного этилового спирта. К этому раствору прибавляют 1—2 капли 1 %-го раствора ацетата кобальта в абсолютном этиловом спирте и 1—2 капли 1 %-го раствора гидроксида калия в абсолютном этиловом спирте. При наличии барбитуратов появляется розовая или красная окраска.

Выполнению этой реакции мешает вода, которая разлагает окрашенное соединение. Поэтому при выполнении указанной реакции используют реактивы, растворенные в абсолютном этиловом или метиловом спирте. Оттенок и интенсивность окраски зависят от применяемого спирта, что объясняется различной сольватирующей способностью образовавшихся соединений этими спиртами. Указанную реакцию дают некоторые гидантоины, сульфаниламидные препараты, пурины, пиримидины и др.

Обнаружение фенобарбитала в биологическом материале по реакции со смесью растворов хлорида железа и иодида калия.

Фенобарбитал со смесью соли железа (III) и иодида калия образует оранжево-коричневые или коричневые кристаллы (призмы и их сростки). Предел обнаружения: 4 мкг фенобарбитала в пробе.

Реактивы и оборудование.

Водный раствор исследуемого вещества, хлороформ, смесь растворов хлорида железа и иодида калия, предметные стекла, пипетки, микроскоп, электрическая плитка.

Ход работы.

На предметное стекло наносят несколько капель раствора исследуемого вещества в хлороформе. Этот раствор выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют каплю реактива. Через 10— 15 мин под микроскопом наблюдают форму образовавшихся кристаллов, которые появляются при наличии ряда барбитуратов (барбамил, бутобарбитал, фенобарбитал, этаминал).

Количественное определение барбитуратов, изолированных из

Биологического материала.

Количественное определение проводят методом спектрофотометрии. Барбитураты обладают специфической абсорбцией в ультрафиолетовой области спектра, при pH 10 и 13 и отсутствии таковой при pH 2. Максимум поглощения – 240 нм (при pH10), 260нм (при pH 13).

Приготовление стандартного раствора барбитуратов. Точную навеску барбитурата (50 мг) помещают в мерную колбу на 1000 мл и растворяют ее в 100 мл фосфатного буфера (pH 7,4) при осторожном перемешивании, затем объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация барбитурата составляет 50 мкг/мл.

Построение калибровочного графика. В ряд мерных колб на 50 мл вносят соответственно 2, 5, 10, 15, 20 мл стандартного раствора барбитурата и доводят до метки боратным буфером (pH 10,0). Измеряют оптическую плотность растворов при λ = 240 нм в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Раствором сравнения служит боратный буфер. По средним значениям из 3 определений строят калибровочный график

Количественное определение барбитуратов, изолированных из биологического материала, проводят следующим образом. 5 млхлороформного извлечения из кислого раствора помещают вделительную воронку и экстрагируют 3 порциями боратногобуфера (15, 10 и 10 мл). Объединенные водные извлечения

собирают в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки боратным буфером. Измеряют оптическую плотность полученного растворапри λ = 240 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см по сравнению с боратным буфером. По калибровочному графику находят содержание данного барбитурата и рассчитывают концентрацию его в исходном биологическом материале по формуле:

m (мкг) = C (мкг/мл) · 50 мл

Вопросы для самоконтроля.

1. Какие токсические вещества экстрагируются из кислых вытяжек, полученных настаиванием биоматериала с подкисленной водой или подкисленным этиловым спиртом?

2. Салицилаты: токсикологическое значение и метаболизм.

3. Реакции обнаружения салициловой кислоты.

4. Почему окраска салицилатов железа зависит от рН среды?

5. Реакции обнаружения фенобарбитала.

6. Какие вещества экстрагируются из подщелоченных вытяжек биоматериала органическими растворителями и почему?

7. Какие реакции и методы используют для обнаружения и идентификации алкалоидов и ЛС основного характера?

Задачи.

1. Рассчитать объем органического растворителя, необходимого для однократной экстракции 98,9 % вещества из 100 см³ раствора при величине константы распределения Р₀ = 30.

2. Определить общий объем органического растворителя, необходимого для многократной экстракции для извлечени 99 % вещества из 100 см³ водного раствора при Р₀ = 20, предполагая использовани в каждой экстракции 25 см³ органического растворителя.

3. Рассчитать число экстракций для извлечения 99,5 % вещества органическим растворителем (порциями по 10 см³) из 100 см³ водного раствора (1,2 моль/дм³ раствор) при Р₀ = 40.