Эффекты инфракрасной люминесценции

Как отмечено в гл. 2, термин «люминесценция» был широко принят в научной фотографии, чтобы отличать фотографирование путем ультрафиолетового возбуждения флуоресценции в видимой области от невидимой инфракрасной флуоресценции. Как уже отмечено в этой главе, в большинстве случаев инфракрасная люминесценция при фотографировании в отраженных лучах не вносит никаких изменений. Однако открытие того факта, что инфракрасную люминесценцию биологических объектов можно сфотографировать {6.99, 6.101], дало возможность раскрыть много неизвестного в ботанике и других областях. Инфракрасная фотография в отраженных лучах дает возможность изучать листву, эмиссионная фотография — нормальное и патологическое распределение хлорофилла в листьях.

Одним из наиболее известных свойств хлорофилла является его флуоресценция в видимой области, которая проявляется как в листе, так и в растворе. Свечение флуоресценции — темно-красное. Оно наблюдалось еще в 1833 г. Брюстером и впервые было изучено Стокеом в 1852 г. Было выполнено множество наблюдений, касающихся характеристик этой флуоресценции, однако при этом у различных исследователей не было согласия относительно фактического положения спектральных полос флуоресценции. Это, по-видимому, обусловлено тем фактом, что хлорофилл изменяется при экспозиции на свету, в результате чего несколько изменяются и полосы флуоресценции; поэтому результаты, полученные в какой-либо момент времени, будут зависеть от предварительной экспозиции на свету. Согласно работам [6.62—6.64] (рис. 6.5), спектр флуоресценции хлорофилла а в эфире имеет два максимума— при 668—723 нм, тогда как хлорофилл b в том же растворителе имеет три максимума — при 648,5, 672 и 705 нм. Алберс и Кнорр [6.1] считали, что эти результаты относятся к хлорофиллу, который изменился за счет экспозиции к свету; они утверждали, что в начале экспозиции положения главных максимумов находятся при 638 и 672 нм в случае формы а и при 637 и 657 нм для формы b.

Рис. 6.5. Спектры флуоресценции хларофиллов а (-------) и b (- - - - -) в эфире

К сожалению, используемый ими метод определения максимумов хотя и является быстрым, но не таким, от которого можно ожидать очень высокой точности. В живом листе хлорофилл совсем не так чувствителен к разложению под действием света, как в растворе, однако Гибсон все же обнаружил эффект утомления [6.100]. Недавняя статья [6.106] содержит богатый материал по эмиссии красного и инфракрасного излучении, зарегистрированной с помощью усовершенствованной аппаратуры. В ней утверждается, что in vivo флуоресценция возникает только в хлорофилле а. Свет, поглощенный хлорофиллом b, передается хлорофиллу а. Для живых растений найдены пики при 685 и 740 нм. Реабсорбция флуоресценции может сдвинуть пики в сторону длинных волн.

Эмиссия хлорофиллов а и b простирается от начала видимой красной до ближней инфракрасной области, а иногда даже далее 830 нм. (См. спектрографические исследования [6.13].) В листе она имеет низкую интенсивность по сравнению с эмиссией хлорофилла в растворе. Однако красную эмиссию листьев можно очень легко наблюдать с помощью подходящих фильтров и интенсивных источников освещения, например солнца. Подходящим является фильтр Kodak Wratten Dichroic № 97. Флуоресценция хлорофилла в видимом участке спектра была использована для отличия маскировки от естественных листьев при проведении военных операций. Однако в общем случае использование лишь одной красной эмиссии не очень полезно при фотографическом картографировании распределения хлорофилла. С другой стороны, очень полезна селективная запись люминесценции в лабораторных условиях.

Очевидно, что для добавки красной компоненты к люминесцентному изображению на инфракрасной пленке требуется светофильтр, который пропускает красное излучение так же хорошо, как и инфракрасное. Фильтр Kodak Wratten № 70 является наиболее эффективным для съемки красноты хлорофилла и люминесценции; фильтр № 87 дает возможность производить селективную съемку пика при 740 нм. Когда необходимо зарегистрировать оба вида излучения (красное и инфракрасное), необходимо использовать фильтр возбуждения, который резко отрезает область длин волн при 650 нм.

Гибсон [6.99] нашел, почему Мек и Болдуин [6.32]: не смогли зарегистрировать инфракрасную люминесценцию. (Они не интересовались фотографированием эмиссии, как таковой.) Они испытали экспозицию, в 1000 раз большую той, которая требовалась бы для фотографирования в отраженном инфракрасном излучении; Гибсон использовал экспозицию, в 22500 раз большую обычной. Рис. 2.14 иллюстрирует его первое исследование. Необходимо отметить, что люминесцируют листья и стебли, содержащие хлорофилл. Однако белые лепестки цветов маргариток не люминесцируют, тогда как имеется слабая люминесценция и» центральной части ее желтого цветка. Белые кромки прицветника лепадины воспроизводятся темными.

Чернота кольца чешуйки на ситнике была обусловлена поглощением зелено-голубого света возбуждения; это предотвращало' доступ к хлорофиллу, расположенному ниже. Интересно также отметить, что листья жестколистных растений не люминесцируют так ярко, как мягколистные. Тот же объект испытаний фотографировался после двухмесячной сушки в лаборатории; были получены сходные результаты. Так же люминеецирует сухой экстрагированный хлорофилл.

В других опытах Гибсон [6.100, 6.101} обнаружил, что желтоватые пигменты стеблей Equisetum arvense не люминесцируют, как зеленые пигменты Е. hymenale. Однако зеленые листья Е. агvense люминесцируют. Раствор резинового цемента, который использовался для крепления листа на рис. 6.6, выщелачивал хлорофилл из части листа. Эти обедненные области не люминесцируют, хотя ткани отражают инфракрасное излучение; никаких нарушений на панхроматической или инфракрасной фотографии, выполненной в отраженных лучах, наблюдать невозможно.

Гибсон разработал метод фотографирования и расчета степени инфракрасной фосфоресценции в веществах, проявляющих значительную стойкость, однако этот метод не достаточно точен для обнаружения крайне короткого послесвечения хлорофилла. Гёдхир [6.106] привел результат около 2 не для высших растений in vivo. Кроме того, Гибсон обнаружил обратимый эффект усталости в инфракрасной люминесценции хлорофилла листьев живых растений. Гарнье [6.93] открыл и заснял с помощью инфракрасной люминесценции некоторые аномалии в механизме фотосинтеза, проявляемые несколькими колониями зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardl. В определенных условиях такие колонии проявляли повышенную флуоресценцию в инфракрасной области при возбуждении излучением с длиной волны менее 600 нм.

Рис. 6.6.Сравнительные снимки, демонстрирующие, что хлорофилл не отражает, а ткань листа не испускает инфракрасного излучения.

а — отражение инфракрасного излучения; б — инфракрасная люминесценция. На снимке б заметно, что цемент, используемый для крепления листа к подложке, выщелочил хлорофилл, который образовал концентрическое кольцо вокруг обедненной области. Другой снимок показывает, что ткань листа не повреждена. Никаких видимых признаков не наблюдалось

Майер [6.118] изучал излучение листьев, просвечиваемых зелено-голубым светом. Он также обнаружил, что бесцветные части пестрых листьев не люминесцируют. В этом отношении стоит упомянуть замечания Фрейтага [6.90] и Лаутеншлагера [6.112].

ПАТОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Из предыдущего рассмотрения следует, что инфракрасная фотография в отраженных лучах является полезным средством изучения и диагностики болезней растений, при которых происходят изменения в составе или структуре клетки. Например, если составные части клеток листа разрушаются паразитами или в результате высыхания, то можно ожидать, что поврежденные области будут распознаны по снимкам. Оказывается, что это действительно так. Автор не встречал ни одной работы, специально посвященной изучению патологии растений люминесцентным методом. Однако любая болезнь, при которой происходит локализованное уменьшение концентрации хлорофилла, необнаруживаемое другим методом, будет оставлять признаки, очевидные для эмиссионного метода. (См. рис. 6.6.) Работа [6.93]; посвящена этой области исследований.