Группа вещ-в, изолируемых экстракцией полярными растворителями.

МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, ОСНОВАННЫЙ НА ИЗОЛИРОВАНИИ ИХ ЭТИЛОВЫМ СПИРТОМ ПОДКИСЛЕННЫМ ЩАВЕЛЕВОЙ КИСЛОТОЙ

Первый метод выделения алкалоидов из биол. м-ла, основанный на изолировании этих веществ этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой, предложил Стас. Затем этот метод модифицировал Отто. Учитывая недостатки метода Стаса — Отто, он не применяется в современном хим.-токс. анализе, а применяется ряд модификаций указанного метода. Одна из них приводится ниже.

100 г тщательно измельченного биол. м-ла вносят в широкогорлую колбу вместимостью 500 мл, заливают этиловым (96°) спиртом до покрытия им твердых частиц исследуемого объекта. Смесь биол. м-ла и этилового спирта подкисляют 10 %-м спиртовым раствором щавелевой кислоты. Содержимое колбы периодически перемешивают стеклянной палочкой. Через некоторое время проверяют рН содержимого колбы и при необходимости прибавляют 10 %-й спиртовой раствор щавелевой кислоты до рН = 2...3.

Колбу слегка закрывают пробкой, оставляют на сутки в теплом месте (25—30 °С) при периодическом перемешивании ее содержимого. После этого кислую спиртовую вытяжку сливают с биол. м-ла. Настаивание биол. м-ла с новыми порциями этилового спирта, подкисленного 10%-м раствором щавелевой кислоты до рН = 2...3, производят еще 3—4 раза (в течение суток каждый раз).

Кислые спиртовые вытяжки из биол. м-ла соединяют и переносят в фарфоровую чашку. Биологический материал переносят на фильтр и промывают этиловым спиртом. Этиловый спирт, которым промывают биологический материал, присоединяют к полученным вытяжкам. Объединенные спиртовые вытяжки упаривают до густоты сиропа на водяной бане, нагретой до 40 °С. К сиропообразной жидкости при перемешивании стеклянной палочкой по каплям прибавляют этиловый спирт (96°) до прекращения выпадания примесей в осадок. Образовавшийся осадок отфильтровывают, фильтр промывают этиловым спиртом. Фильтрат снова упаривают на водяной бане до густоты сиропа, как указано выше. Из сиропообразного остатка примеси осаждают этиловым спиртом. Упаривание спиртовых фильтратов и осаждение примесей этиловым спиртом из сиропообразной жидкости проводят многократно (до прекращения осаждения примесей от прибавления этилового спирта).

К очищенной таким образом сиропообразной жидкости прибавляют 25 мл воды. Если при этом образуется осадок, его отфильтровывают.

Кислую водно-спиртовую жидкость переносят в делительную воронку, прибавляют 10—15 мл хлороформа и легко взбалтывают в течение 5 мин, а затем отделяют хлороформную вытяжку. Кислую водно-спиртовую жидкость еще 2—3 раза взбалтывают с новыми порциями хлороформа (по 10—15 мл). Хлороформные вытяжки из кислой водно-спиртовой жидкости соединяют и исследуют на наличие ядовитых соединений, экстрагирующихся органическими растворителями из кислой среды.

Оставшуюся в делительной воронке кислую жидкость подщелачивают 25 %-м раствором аммиака до рН = 9...10. Из этой подщелоченной жидкости алкалоиды и другие токсические вещества 3—4 раза экстрагируют новыми порциями хлороформа (по 10— 15 мл). Хлороформные вытяжки соединяют и исследуют на наличие алкалоидов и некоторых других токсических веществ основного характера.

Описанный выше метод выделения токсических веществ из биол. м-ла, основанный на изолировании их этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой, является трудоемким. Для выделения токсических веществ из биол. м-ла с помощью этого метода требуется 8—10 рабочих дней. На один анализ расходуется около 500 мл этилового спирта. В связи с большим количеством операций, связанных с осаждением примесей из вытяжек, в ходе химико-токсил. анализа могут теряться определенные количества ядовитых веществ, адсорбирующихся примесями.

Несмотря на указанные выше недостатки метода изолирования токсических веществ подкисленным этиловым спиртом, этот метод является эффективным для выделения ядовитых соединений из гнилостного биол. м-ла.

МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, ОСНОВАННЫЙ НА ИЗОЛИРОВАНИИ ИХ ВОДОЙ, ПОДКИСЛЕННОЙ ЩАВЕЛЕВОЙ КИСЛОТОЙ

В современном хим.-токс. анализе для изолирования алкалоидов и других токсических веществ из биол. м-ла используется вода, подкисленная щавелевой кислотой. На применении этой извлекающей жидкости основан метод выделения алкалоидов по А. А. Васильевой. Этот метод сыграл определенную роль в развитии химико-токсил. анализа в нашей стране. Однако метод А. А. Васильевой имеет и ряд недостатков. Из-за наличия недостатков оригинальный метод А. А. Васильевой в настоящее время не применяется в хим.-токс. анализе. Ниже приводится описание современного метода выделения алкалоидов и других токсических веществ из биол. м-ла, основанный на изолировании их водой, подкисленной щавелевой кислотой.

100 г мелко измельченного трупного м-ла вносят в колбу вместимостью 500 мл. Трупный материал заливают 200 мл воды, подкисленной насыщенным водным раствором щавелевой кислоты до рН = 2,0...2,5. Смесь биол. м-ла и подкисленной воды оставляют на 2 ч при периодическом перемешивании содержимого колбы. После указанного времени кислую водную вытяжку сливают с трупного м-ла, который еще раз в течение часа настаивают с водой, подкисленной щавелевой кислотой до рН = 2,5, а затем кислую водную вытяжку сливают с трупного м-ла. Кислые водные вытяжки соединяют и процеживают через двойной слой марли. Процеженную вытяжку подвергают центрифугированию. Надосадочную жидкость из центрифужного стакана переносят в делительную воронку. Эту жидкость 3—4 раза взбалтывают с новыми порциями хлороформа (по 15—20 мл). Хлороформные вытяжки из кислой среды соединяют и исследуют на наличие токсических веществ, которые экстрагируются хлороформом из кислой среды.

Оставшуюся в делительной воронке кислую водную вытяжку подщелачивают 25 %-м раствором аммиака до рН = 10 и 3—4 раза взбалтывают с хлороформом (порциями по 15—20 мл). Хлороформные вытяжки из щелочной среды соединяют и исследуют на наличие алкалоидов, их синтетических аналогов и других органических веществ основного характера.

Описанный выше метод, основанный на изолировании токсических веществ водой, подкисленной щавелевой кислотой, имеет ряд преимуществ перед методом изолирования этих веществ этиловым спиртом, подкисленным той же кислотой. При изолировании алкалоидов и других токсических веществ подкисленной водой в несколько раз сокращается время анализа. Для выделения токсических веществ с помощью этого метода не требуется применение этилового спирта. Однако описанный выше метод изолирования токсических веществ непригоден для выделения из биол. м-ла соединений, нерастворимых в подкисленной воде. Кроме этого, данный метод ограниченно пригоден для выделения токсических веществ из загнившегося биол. м-ла.

МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, ОСНОВАННЫЙ НА ИЗОЛИРОВАНИИ ИХ ВОДОЙ, ПОДКИСЛЕННОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ

Воду, подкисленную серной кислотой, для изолирования алкалоидов из биол. м-ла впервые применил Г. Драгендорф в 1865 г. В связи с рядом недостатков метод Драгендорфа не нашел широкого применения в хим.-токс. анализе.

В. Ф. Крамаренко изучил основные причины потерь алкалоидов при выделении их из биол. м-ла по методу Драгендорфа и по ряду других методов. При этом установлено, что частичная потеря алкалоидов в ходе химико-токсил. анализа объясняется связыванием этих веществ с биологическим материалом. Потери алкалоидов также могут быть в результате неправильного выбора рН извлекающей жидкости, применяемой для изолирования этих веществ из биол. м-ла, а также в результате неправильного выбора рН среды при очистке полученных вытяжек и при экстракции алкалоидов из предварительно очищенных вытяжек.

Учитывая результаты указанных исследований, В. Ф. Крамаренко предложил описанный ниже метод выделения алкалоидов из биол. м-ла. 100 г измельченных органов трупов вносят в стакан вместимостью 250—500 мл и заливают 0,02 н. раствором серной кислоты с таким расчетом, чтобы твердые частицы биол. м-ла были покрыты этой жидкостью. Содержимое стакана перемешивают стеклянной палочкой и с помощью универсального индикатора проверяют рН среды. Если рН среды превышает 2,5, то к смеси биол. м-ла и подкисленной воды.по каплям прибавляют 20 %-й раствор серной кислоты до рН-2,5. Содержимое стакана оставляют на 2 ч при периодическом перемешивании, а затем процеживают через марлю. Твердые частицы биол. м-ла еще дважды настаивают с новыми порциями 0,02 н. раствора серной кислоты, доводя рН до 2,5 и настаивая в течение часа.

Кислые водные вытяжки из биол. м-ла соединяют, переносят в стакан для центрифугирования вместимостью 200 мл и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а остаток в центрифужном стакане перемешивают стеклянной палочкой и заливают 20—30 мл 0,2 н. раствора серной кислоты. Содержимое центрифужного стакана настаивают в течение 2 ч и центрифугируют. Надосадочную жидкость присоединяют к ранее полученной надосадочной жидкости. Объединенные надосадочные жидкости (центрифугат А) подвергают дальнейшему исследованию.

1. При исследовании загнившегося биол. м-ла на наличие токсических веществ к центрифугату А прибавляют кристаллический сульфат аммония до насыщения жидкости этим электролитом. Через 1—2 ч образующийся осадок примесей отделяют от жидкости центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают с осадка и проверяют степень кислотности этой жидкости. При необходимости жидкость доводят до рН = 2,0...2,5 прибавлением 10 %-го раствора серной кислоты. Подкисленную до рН = 2,0...2,5 жидкость дважды взбалтывают с диэтиловым эфиром (по 40 мл). Эфирные вытяжки, содержащие примеси, отделяют от кислой водной фазы и в дальнейшем не исследуют.

Кислую водную фазу подщелачивают 20%-м раствором гидроксида натрия до рН = 8,5...9,0 и 3 раза взбалтывают с хлороформом (объем хлороформа, взятый для каждой экстракции, должен быть в три раза меньше объема водной фазы). Хлороформные вытяжки соединяют, профильтровывают и на водяной бане отгоняют хлороформ до небольшого объема (10—15 мл). Оставшийся хлороформ выпаривают на воздухе досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. В полученном растворе определяют наличие алкалоидов.

Если раствор сухого остатка в 0,1 н. растворе соляной кислоты имеет бурую окраску или содержит окрашенные взвешенные частицы, то его 1—2 раза взбалтывают с равным объемом изоамилового спирта. Этот спирт, содержащий примеси, отделяют от кислой водной фазы, в которой определяют наличие алкалоидов и других токсических веществ.

2. При исследовании незагнившегося биол. м-ла осаждение примесей из вытяжек сульфатом аммония не производится, Центрифугат А дважды взбалтывают с диэтиловым эфиром по 30 мл. Эфирные вытяжки отделяют и в дальнейшем не исследуют. Кислую водную фазу подщелачивают 20%-м раствором гидроксида натрия до рН = 8,5...9,0 и 3 раза взбалтывают с хлороформом (объем хлороформа для каждой экстракции должен быть в 3 раза меньше, чем объем водной фазы). Хлороформные вытяжки соединяют и хлороформ отгоняют на водяной бане до небольшого объема (10—15 мл). Оставшийся хлороформ на воздухе выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. В полученном растворе определяют наличие алкалоидов и других токсических веществ.

3. В тех случаях, когда биологический материал подвергают исследованию на наличие ядовитых веществ, экстрагирующихся из кислых водных вытяжек, центрифугат А доводят 20 %-м раствором гидроксида натрия до рН = 4...5 и 3 раза взбалтывают с хлороформом (объем хлороформа должен быть в 3 раза меньше, чем объем водной фазы). Хлороформные вытяжки соединяют и отгоняют хлороформ, как указано выше. Сухой остаток растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. В этом растворе определяют наличие ядовитых веществ, экстрагирующихся из кислой среды.

РАЗВИТИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ И ДРУГИХ АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИЙ ИЗ БИОЛ. М-ЛА

В 1823 г. Лассань предложил метод выделения морфина из органов трупов. Это был первый метод выделения алкалоидов, предложенный для целей судебно-химического анализа. Согласно этому методу, биологический материал, подлежащий исследованию на наличие алкалоидов, непродолжительное время кипятят с водой, а затем фильтруют. Полученную водную вытяжку выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в этиловом спирте. Спиртовой раствор сухого остатка используют для обнаружения алкалоидов. М. Ж. Орфилла применил метод Лассаня для выделения ряда других алкалоидов из объектов биол. происхождения.

Метод выделения алкалоидов из биол. м-ла, предложенный Лассанем, имел ряд существенных недостатков. Основания большинства алкалоидов не растворяются в воде и не выделяются из биол. м-ла при помощи этого метода. Сухие остатки алкалоидов, выделенных из биол. м-ла по Лассаню, как правило, содержат большое количество примесей, мешающих обнаружению исследуемых веществ при помощи соответствующих реакций.

Изолирование алкалоидов подкисленным спиртом. Первый метод изолирования алкалоидов из биол. м-ла подкисленным спиртом в 1851 г. предложил Ж. С. Стас. Для подкисления этилового спирта он применил щавелевую и винную кислоты. Однако он не производил очистку вытяжек из биол. м-ла от примесей. Способ очистки спиртовых вытяжек, полученных по методу Стаса, в 1856 г. предложил Ф. Отто. Для очистки кислых алкалоидных вытяжек он применил метод экстракции примесей диэтиловым эфиром. Метод Стаса, модифицированный Ф. Отто, в литературе получил название метод Стаса — Отто. Согласно этому методу, биологический материал несколько раз настаивают с этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой. Полученные кислые спиртовые вытяжки сливают с твердых частиц биол. м-ла и фильтруют. Профильтрованные спиртовые вытяжки упаривают до густоты сиропа, прибавляют абсолютный (или 96°) этиловый спирт, осаждающий примеси белковых и других веществ в виде хлопьев. Эти хлопья отфильтровывают. Фильтр промывают этиловым спиртом. Фильтрат и этиловый спирт, взятый для промывания фильтра, соединяют и снова выпаривают до густоты сиропа, а затем примеси осаждают этиловым спиртом. Эту операцию повторяют несколько раз (до тех пор, пока из сиропообразной жидкости не прекратится осаждение примесей этиловым спиртом). Кислые спиртовые вытяжки, из которых осаждены белковые и другие вещества, разбавляют водой и взбалтывают с диэтиловым эфиром, в который переходят примеси, неосаждаюшиеся абсолютным этиловым спиртом. Освобожденные таким образом от примесей кислые спиртовые вытяжки из биол. м-ла подщелачивают карбонатом натрия или аммиаком и взбалтывают с диэтиловым эфиром, в который переходят алкалоиды. Эфирные вытяжки выпаривают, а в полученных остатках определяют наличие алкалоидов.

Метод Стаса — Отто на протяжении многих десятилетий подвергался различным модификациям. Эти модификации касаются выбора кислот и щелочей, применяемых при выделении алкалоидов из биол. м-ла, способов очистки вытяжек от примесей и т. д. Для подкисления этилового спирта вместо щавелевой кислоты предложены винная, серная, соляная и уксусная кислоты. Для подщелачивания алкалоидных вытяжек, из которых экстрагируют алкалоиды, предложены гидроксид натрия и гидроксид бария. Вместо диэтилового эфира для экстракции алкалоидов из подщелоченных вытяжек предложены хлороформ, бензол, амиловый спирт и другие несмешивающиеся с водой органические растворители.

Изолирование алкалоидов подкисленной водой. В 1856 г. С. Макадам для изолирования алкалоидов из биол. м-ла применил воду, подкисленную щавелевой кислотой. Для очистки полученных вытяжек он использовал активированный уголь. Воду, подкисленную щавелевой кислотой, для изолирования алкалоидов из пищевых продуктов растительного происхождения в 1943 г. применили М. Д. Швайкова и А. В. Степанов. В 1949 г. А. А. Васильева использовала принцип метода М. Д. Швайковой и А. В. Степанова для изолирования алкалоидов из органов трупов водой, подкисленной щавелевой кислотой.

Согласно методу А. А. Васильевой, трупный материал измельчают и заливают водой, подкисленной щавелевой кислотой. Вытяжку процеживают через марлю. Процеженную кислую водную вытяжку взбалтывают с хлороформом, который отделяют от водной фазы. После этого кислую водную вытяжку подщелачивают и взбалтывают с хлороформом. В хлороформной вытяжке определяют наличие алкалоидов.

Фильтрование вытяжек из биол. м-ла согласно методу А. А. Васильевой не производится. Процеженные через марлю кислые водные вытяжки являются мутными, загрязненными не только растворимыми в воде примесями, но и мелкими частицами биол. м-ла. Степень кислотности смеси биол. м-ла и подкисленной воды контролируется только по лакмусу. Определение рН кислых и подщелоченных вытяжек из биол. м-ла не производится.

Воду, подкисленную соляной кислотой, для изолирования алкалоидов из биол. м-ла предложили Усляр и Эрдман в 1861 г. Позднее для подкисления воды были предложены фосфорная, винная, уксусная и другие кислоты.

В 1865 г. Г. Драгендорф для выделения алкалоидов из биол. м-ла предложил метод, основанный на изолировании этих веществ водой, подкисленной серной кислотой. Согласно методу Г. Драгендорфа, измельченные органы трупов 2—3 раза настаивают в воде, подкисленной серной кислотой. Каждый раз настаивание производится в течение нескольких часов при нагревании до 40—50 °С. Полученные после каждого настаивания кислые водные вытяжки из биол. м-ла сливают, соединяют, процеживают и выпаривают до густоты сиропа. К сиропообразному остатку прибавляют этиловый спирт и настаивают в течение 24 часов, а затем отфильтровывают образовавшийся осадок. Фильтрат нагревают до улетучивания этилового спирта. После этого к фильтрату прибавляют воду. Полученную кислую водную вытяжку взбалтывают с петролейным эфиром, затем с бензином, хлороформом и снова с петролейным эфиром. Вытяжки, полученные с помощью указанных органических растворителей, исследуют на наличие теобромина, наркотина, папаверина, бруцина и других алкалоидов. Затем кислые водные выгяжки подщелачивают аммиаком до щелочной реакции (по лакмусу). Из подщелоченных вытяжек последовательно экстрагируют алкалоиды бензином и амиловым спиртом. Пользуясь этим методом, при нагревании биол. м-ла с раствором серной кислоты в вытяжки переходит значительное количество примесей, являющихся продуктами гидролиза белковых веществ. В этих условиях отдельные алкалоиды, представляющие собой сложные эфиры (атропин, скополамин, кокаин и др.), могут подвергаться гидролизу.

Первые методы изолирования ядовитых веществ из биол. м-ла подкисленным этиловым спиртом и подкисленной водой, предложенные вначале второй половины XIX ст., применялись только для выделения алкалоидов. В то время химия синтетических азотсодержащих фармацевтических препаратов основного характера (аналогов алкалоидов) была только в начальной стадии развития. Поэтому синтетические фармацевтические препараты не применялись в медицине и не были причиной отравлений. Начиная с конца XIX ст. в медицинскую практику все больше начали внедряться синтетические фармацевтические препараты, отдельные представители которых в ряде случаев были причиной отравлений. Для выделения этих синтетических препаратов из биол. м-ла специальные методы не разрабатывались, а применялись методы, ранее предложенные для исследования алкалоидов.

Все описанные выше методы выделения алкалоидов из биол. м-ла имеют ряд недостатков. Согласно этим методам, изолирование алкалоидов и синтетических азотсодержащих ядовитых веществ основного характера производилось без учета влияния рН извлекающих жидкостей (подкисленного этилового спирта или подкисленной воды) на степень выделения исследуемых веществ из биол. м-ла. Не учитывалось влияние рН среды на экстракцию примесей из алкалоидных вытяжек и на экстракцию алкалоидов и их синтетических аналогов из предварительно очищенных вытяжек. Выбор органических растворителей для экстракции примесей, переходящих из биол. м-ла в вытяжки, а также для экстракции алкалоидов и других веществ из вытяжек производился эмпирически.