Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen

Zur Charakterisierung der Fettverteilung in Schäumen wurden diese fluoreszenzmikrosko-

pisch untersucht. Ziel war es, mit Hilfe dieser Methode eine genauere Betrachtung der Fett-

kugeln zu ermöglichen. Zur Untersuchung der fetthaltigen Schäume wurde ein Forschungs-

Mikroskop mit einem Fluoreszenzkondensor (BX 50, Fa. Olympus, Hamburg) verwendet.

Zum Anfärben der Fette in den Schäumen wurde der Fluoreszenzfarbstoff Nilrot verwendet.

Dieser Farbstoff ist löslich und stark fluoreszierend in organischen Lösungen und eignet sich

zum Anfärben von Fetten [Greenspan & Stanley, 1985]. Nilrot wurde in Azeton gelöst

(0,01 %). Durch die Zugabe einer Fuchsinlösung (0,01 %) konnte der Kontrast der mikrosko-

pischen Bilder erhöht werden [King, 1955]. Der Schaum wurde auf den Objektträger aufge-

tragen und jeweils ein Tropfen Nilrot- und Fuchsinlösung dazugegeben. Die Anregung des

Fluoreszenzfarbstoffes erfolgte mit einer Halogenlampe (100 W, Fa. Philips).

Zusätzlich wurde untersucht, ob es auch bei einer direkten Zugabe der Nilrotlösung zu der

Milchprobe vor dem Aufschäumen zu einer Schaumbildung kommt. Hierzu wurde 1 ml Nil-

rotlösung in die Milchprobe gegeben und anschließend aufgeschäumt. Mit Hilfe einer Digi-

talkamera (Polaroid Model DMC1, Polaroid Corporation, Cambridge/USA) wurden Bilder

der Schäume aufgenommen.

3.5.5 Präparation der Schäume für elektronenmikroskopische Untersuchungen

Um detaillierte Erkenntnisse über den Aufbau der Grenzfläche Luft/Wasser in Milchschäu-

men zu erhalten, wurden die Schäume elektronenmikroskopisch untersucht. Als Probenmate-

rial wurden frisch aufgeschäumte Milchproben sowie Milchschäume nach einer Standzeit von

20 Minuten verwendet. Für die Elektronenmikroskopie müssen sehr dünne (0,1 µm) und im

Vakuum beständige Präparate hergestellt werden. Daher wurden die Proben in flüssigem Pro-

panstrahl eingefroren und ein Präparatabdruck (Gefrierbruchtechnik) hergestellt.

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3.5.5.1 Einfrieren der Schäume

Die Schäume wurden im flüssigen Propanstrahl eingefroren (Jet-Gefriergerät JFD 030, Bal-

zers, Lichtenstein). Eine Übersicht des Präparationsvorgangs ist in Abbildung 3.6 dargestellt.

Eine Spatelspitze Schaum wurde auf ein Goldträgernetzchen (0,7 µm dick, 3,05 mm Durch-

messer, Gilder Netzchen, BAL-TEC, Witten/Deutschland) aufgebracht (2) und das Netzchen

mit dem Schaum auf ein kupfernes Trägerplättchen (flache Oberfläche, 4,5 mm x 3 mm,

0,6 mm hoch, BAL-TEC, Witten/Deutschland) platziert (3). Ein zweites Trägerplättchen (mit

Vertiefung, 4,5 mm x 3 mm, 0,6 mm hoch, BAL-TEC, Witten) wurde oben aufgesetzt (4-5).

Dieses „Präparat-Sandwich“ wurde in den Probenhalter eingesetzt und in das Jet-Gefriergerät

(JFD 030, Balzers, Lichtenstein) überführt. Beim Herunterdrücken des Probenhalters wurde

kurzfristig ein Propangas-Ventil geöffnet und flüssiges Propan fror das „Präparat-Sandwich“

bei -180 °C ein. Anschließend wurden die Präparate aus dem Einfriergerät entnommen und in

flüssigen Stickstoff überführt.

Abb. 3.6: Herstellung eines Sandwich-Präparates (Quelle: Gebrauchsanleitung Jet-

Gefriergerät)

3.5.5.2 Herstellung des Präparatabdrucks (Gefrierbruchtechnik)

Es wurden jeweils drei der in flüssigen Stickstoff gelagerten Sandwich-Präparate in eine vor-

gekühlte Doppelabdruckeinrichtung (BAL-TEC,Witten) eingeführt. Die Abdruckeinrichtung

mit den drei Proben wurde in die Vakuumkammer einer Hochvakuum-Gefrierätzanlage

(BA 360 M, Balzers, Lichtenstein) gesetzt und befestigt. Der Objektträgertisch der Vakuum-

kammer wurde zur besseren Kälteübertragung mit flüssigem Frigen bepinselt. Die Kammer

wurde geschlossen und ein Hochvakuum aufgebaut. Bei einer Temperatur von –120 °C wurde

die Doppelabdruckeinrichtung aufgerissen, so dass die eingefrorenen Schäume gebrochen

wurden. Aus diesen Stücken ragten nun an manchen Stellen die in der Milch enthaltenen Teil-

chen wie Fettkügelchen und Caseinteilchen heraus oder waren entlang natürlicher Grenzflä-

chen aufgebrochen. In Abbildung 3.7 ist beispielhaft ein Überblick der erzeugten Strukturen

durch die Gefrierbruchtechnik abgebildet.

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Abb. 3.7: Gefrierbruchtechnik (Pt/C = Platin/Kohlenstoff; C = Kohlenstoff)

Die Brechung der Probe erfolgte entlang innerer Oberflächen. Wenn große Partikel, Fettku-

geln oder koalesziertes Fett vorlagen, konnten diese auch gebrochen werden. Damit die frei-

gelegten Objektdetails einer elektronenmikroskopischen Untersuchung zugeführt werden

konnten, wurde von der Oberfläche ein Abdruck hergestellt. Im Vakuum wurden Platin und

Kohlenstoff (Winkel 45 °) verdampft, wobei sich eine dünne Schicht auf dem Objekt nieder-

schlug. Zur Verstärkung wurde mit Kohlenstoff (Winkel 90 °) beschattet. Nach dem Auf-

dampfen der Abdruckschicht wurde die Vakuumanlage belüftet, die Kupferträger mit den

Goldträgernetzchen und den bedampften Bruchstücken entnommen, in destilliertes Wasser

gegeben und somit die Abdruckschicht isoliert. Um weitere Objektreste von der Kohle-Platin-

Schicht zu entfernen, wurde der Abdruck 30 Minuten in Chlorbleichlauge, wieder in destil-

liertes Wasser, Azeton und nochmals in destilliertes Wasser gegeben. Anschließend wurde der

Abdruck auf Papier getrocknet und konnte nun für die elektronenmikroskopischen Untersu-

chungen verwendet werden [Böhler, 1969, Buchheim, 1971, Kaláb, 1981, Schmidt &

Buchheim, 1992].

3.5.5.3