Понятие о геноме и методы его секвенирования

       Геном – это совокупность всех генов данной особи, или ДНК, содержащаяся в гаплоидном наборе хромосом клетки определенного вида организма. В расширенном виде под геномом понимается вся наследственная система клетки (Тарантул В. З., 2003; У. Клаг, М. Каммингс, 2009).

       Термин «геном» впервые был предложен в 1920 г. немецким генетиком Г. Винклером. К тому времени уже существовал термин «генотип», под которым понималась совокупность всех наследственных задатков данной конкретной клетки или данного конкретного организма. Часто под генотипом понималось ограниченное число анализируемых аллелей и генов. Термин геном, по замыслу его автора, должен был относиться к целому виду организмов, а не конкретной особи. К настоящему времени он может относиться и к конкретной особи. Так что, если рассматривать только в структурном плане, то различия между этими двумя терминами не столь и очевидны.

       Однако впоследствии к структурному понятию генома добавились и регуляторные особенности работы генов в разном возрасте и при разных условиях, а также участие в процессе жизнедеятельности кроме ядра и других органелл клетки, в частности, митохондрий и хлоропластов. То есть, для понимания генома важна не только его структура, но и функциональные особенности (М. Д. Голубовский, 2000, а).

       Расшифровка генома была начата с секвенирования (от англ. sequence - последовательность) последовательностей пар нуклеотидов в ДНК. Огромное значение при этом сыграло открытие Мюллисом (Kary Baron Mullis) полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1983 году. В настоящее время ПЦР признана как наиболее производительная и относительно простая технология амплификации (многократного копирования) небольших количеств образцов ДНК, которая способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов (Newton, Graham,1997 – цит. по В. Е. Падутов и др.. 2007; Д. В. Политов, 2008;).

       В конце прошлого века было предложено 2 метода расшифровки структуры ДНК: химического расщепления по А. Максаму и У. Гилберту и терминации цепи по Фреду Сенжеру (нобелевская премия). Наиболее удобной оказалась модификация метода англичанина Фреда Сэнжера с применением флуоресцентных дидезоксинуклеотидтрифосфатов (В. З. Тарантул, 2003; В. Е. Падутов и др., 2007).

       Согласно методу Ф. Сэнжера молекулу ДНК с помощью специальной обработки ферментами расщепляют на фрагменты и расплетают её двойную спираль на две нити. Затем по каждому из полученных обрывков нитей с помощью специальных затравок восстанавливают недостающую вторую нить ДНК. При этом синтез второй нити осуществляется не полностью, а с помощью специального приема останавливается на одном из 4 специализированных нуклеотидов. В результате получают набор цепей ДНК разной длины, но имеющие, по крайней мере, один одинаковый конец, или одну точку отсчета. В этот фиксированный конец вводят радиоактивную или флуоресцентную метку. После этого проводят дальнейшие специфические расщепления молекул с помощью ферментов или химических агентов по строго определенным азотистым основаниям. Для проведения этих работ созданы специальные автоматы-секвенаторы.

       Полученные фрагменты разделяют по размерам с помощью электрофореза в гелях. Электрофоретическое разделение проводят в вертикальных или горизонтальных электрофоретических камерах. Для агарозных гелей чаще применяются горизонтальные камеры, а для полиакриламидных – как горизонтальные, так и вертикальные (рис. 7.1).

Рис. 7.1. Основные типы используемых электрофоретических камер (по В. Е. Падутову и др., 2007).

 

Небольшие фрагменты движутся быстрее, чем более крупные, и в результате все фрагменты выстраиваются друг за другом в зависимости от своих размеров (рис. 7.2). Так осуществляют секвенирование небольших фрагментов ДНК (до 1000 нуклеотидов). Однако геномы даже самых примитивных организмов имеют размеры свыше 500 000 п. н. Для их секвенирования разработаны специальные подходы.

 

Рис. 7.2. Общий принцип электрофоретического фракционирования молекул ДНК (по В. Е. Падутову и др., 2007).

 

       Для определения нуклеотидной последовательности ДНК у геномов простейших организмов разрезают её на небольшие фрагменты с помощью ферментов рестриктаз. Потом секвенируют эти кусочки по отдельности, а затем склеивают из них полный геном. Склеивание осуществляется за счет того, что нуклеотидные последовательности разных кусочков перекрываются друг с другом, т. е. одинаковы по концам (рис. 7.3.).

       Для секвенирования более сложных геномов (человека и других эукариот) использовались предварительно составленные генетические карты хромосом. Участки ДНК с определенными генами с помощью рестриктаз дробили на миллионы перекрывающихся между собой по нуклеотидной последовательности фрагментов, разбирали каждый из них по отдельности, после чего из них склеивали оригинал. В результате были созданы физические карты разных областей ДНК и целых хромосом, состоящие их последовательно перекрывающихся друг с другом фрагментов. Набор таких родственных фрагментов называется контиг (рис. 7.3.).

       Развитие технологий секвенирования ДНК уже к концу 20-го столетия позволило определить первичную структуру ДНК у 18 микроорганизмов с размерами геномов до 20

Рис. 7.3. Схема стратегии «дробовика», используемая для секвенирования больших молекул ДНК (по В. З. Тарантул, 2003).

 

млн.п.н. (архебактерии, спирохеты, хламидобактерии, кишечная палочка, микоплазмы, риккетсии, цианобактерии и др. возбудители болезней человека). Наименьший размер генома у свободно живущих организмов (например, у бактерии Mycoplasma genitalium)составляет лишь около 600 000 п. н. У этой бактерии имеется всего 500 генов. При этом удаление из них (поодиночке) 150 не повлияло на её жизнедеятельность. То есть, элементарный организм может жить при наличии 350 генов.

К настоящему времени расшифрованы геномы человека, мыши, свиньи и др.высших организмов, а также свыше 90 геномов микроорганизмов (В. З. Тарантул, 2003; У. Клаг, М. Каммингс, 2009; Press release…, 2009). В 2006 г. было завершено полное секвенирование генома тополя волосистоплодного – Populus trichocarpa. Torr. & Gray ex Brayshaw (G. A. Tuskan, S. P. DiFasio, U. Hellsten et al. – цит. по К. В. Крутовский, 2006). Наибольшее же значение имела расшифровка генома человека, поскольку она оказала революционирующее значение для развития работ в данном направлении.

      

Геном человека

       Успехи в секвенировании поставили в повестку дня расшифровку генома человека. В 1988 году был создан проект «Геном человека» Национального института здоровья США во главе с нобелевским лауреатом Джеймсом Уотсоном. В том же году в СССР по инициативе академика А. А. Баева была принята государственная программа с тем же названием. Позднее к программе подключились другие страны, а координация исследований стала проводиться международной организацией ХУГО (HUGO - Human Genom Organisation). На работу по секвенированию генома человека, осуществленной этим консорциумом было потрачено более 3 миллиардов долларов. При этом вклад России был очень небольшим, и сейчас при подсчетах его просто не учитывают (В. З. Тарантул, 2003).

       В первые 2 года работы скорости секвенирования были очень низкие, так что завершение проекта можно было ожидать в течение 100 лет. Одной стране это было не под силу. К проекту было привлечено 20 государств. Организован международный банк данных, куда направлялась вся полученная информация. Постепенно возрастала производительность аппаратуры, стали использоваться промышленные роботы, многие процессы были автоматизированы. И вскоре скорость секвенирования достигла 10 млн. нуклеотидных пар в сутки. За 1995 г. длина участков ДНК человека с установленной последовательностью нуклеотидов увеличилась почти в 10 раз, но это составляло пока менее 0,001% от всего генома человека. К началу 1998 г. было секвенировано всего около 3% генома.

       Примерно в это время к работе по секвенированию ДНК человека подключилась частная американская компания из штата Мериленд «Селера геномикс» (Celera Genomics) под руководством Крега Вентера, которая на эти работы потратила ещё 3 млрд. долларов. Работы резко ускорились. В конце 1999 года в журнале “Nature” появилась публикация о секвенировании одной из самых малых хромосом -22-й.

В американском журнале “Time” от 26 февраля 2001 года (стр.16) опубликованы данные о первых результатах расшифровки генома человека (к тому времени было расшифровано 33% генома человека). Здесь было отмечено, что:

- 99,9% генов являются идентичными у всех людей мира.

- Максимальное число генов в клетках человека около 40 000, но может быть и 27 000. До начала секвенирования предполагалось, что в геноме человека около 100 000 генов. Следует отметить, что после почти полной расшифровки генома было установлено, что число генов, кодирующих белки у человека колеблется от 20 000 до 25 000 (Press release…, 2004).

- 40% наших генов совпадают с генами нематодного червя; 60% такие же как у плодовой мушки и 90% таких же как у мыши.

- 99% нашей ДНК идентично ДНК шимпанзе (в 2007 году шимпанзе была клонирована).

- 223 гена наши предки получили непосредственно от бактерии.

К началу 2003 г. геном человека был в основном секвенирован, т.е. определен порядок расположения нуклеотидов во всех молекулах ДНК на всех хромосомах. Он состоит из 3,2 млрд. п. н. (пар нуклеотидов). Сообщается, что для анализа фирма Celera Genomics использовала геном 5 человек (3 мужчины и 2 женщины), относящихся к разным расам: афро-американской, монголоидной и европеоидной. Международный консорциум HUGO использовал материал не менее 7 различных людей. Проект «Геном человека» был завершен в 2004 году, а его результаты опубликованы в международном журнале “Nature” (2004, том 431, с. 931-945).

Геном человека состоит из 24 хромосомы. 22 из них – соматические и 2 (X и Y) – половые. При этом у женщин содержится только 23 хромосомы (у них отсутствует Y- хромосома). Общая характеристика хромосом представлена в табл. 7.1.

Как видно из данных таблицы 7.1 наибольший размер имеет хромосома 1 (263 млн. п. н.), а наименьший – хромосома 21 (50 млн.п.н.). Число генов у соматических хромосом колеблется от 204 до 2237. в хромосоме Х оно составляет 717, а в хромосоме Y- 82.

В четвертой колонке этой таблицы показано число генов, ассоциированных с болезнями человека. Так, моносомия по Х хромосоме (т.е. фенотипически женская особь имеет только одну хромосому Х) обусловливает синдром Шерешевского-Тернера, а лишняя Х-хромосома (XXY) – синдром Клайнфельтера.

Таблица 7.1.