Какова же методика разбавления спермы?

Приготовленную синтетическую среду помещают в бактерицидную камеру, термостат или водяную баню с температурой 30°Си в теплом виде применяют для разбавления спермы. Срок использования среды не должен превышать 3-4 ч с момента ее приготовления. Перед разбавлением температура сред и спермы должна быть одинаковой, чтобы устранить возможность температурного шока спермиев.

Работу со спермой производят после ее получения и оценки. Работу по разбавлению спермы проводят в специальной стерильной камере или в лаборатории, облученной бактерицидными лампами БУВ-30 или БУВ-60. Вначале сперму быка разбавляют в спермоприемнике 1:1 -1:2 и после 5-10 минутной выдержки разбавляют дополнительно до нужного объема. После разбавления сперму обязательно проверяют под микроскопом на активность спермиев.

Качество синтетической среды определяют биологическим путем, по выживаемости спермиев при различных степенях разбавления спермы и их сохранности при температуре 2-4°С. Оптимальную степень разбавления спермы определяют по наибольшему показателю абсолютной выживаемости спермиев.

Минимальные показатели спермы производителей,

допускаемой к разбавлению в искусственных средах 159

Проверка качества разбавителя. Берется капля свежеполу-ченной спермы и определяется ее активность, затем добавляют туда по каплям 3-4 капли разбавителя, если спермии не теряют свою активность, значит разбавитель приготовлен правильно. Если теряет активность, разбавитель приготовлен не верно. 160

гЛАВА 7. Хранениеитранспортировкаспермы

Племенные предприятия занимаются получением, сохранением и обеспечивают хозяйства спермой от высокоценных самцов производителей.

Но каковы же теоретические основы и способы сохранения спермы?

Хранение спермы вне организма является одной из центральных проблем не только искусственного осеменения, но и племенного дела. Эффективность работы племпредприятий в большой степени зависит от применяемых ими способов хранения спермы. Способы, обеспечивающие хранение спермы в течение короткого времени, затрудняют индивидуальный подбор маток к производителям и рациональное использование их спермы.

Каково значение способов хранения спермы?

Чем интенсивнее происходит обмен веществ в спермиях, тем скорее он погибает. Для удлинения жизни спермиев необходимо повысить их жизнестойкость путем хорошего кормления и содержания производителей. Нужно замедлить обменные процессы в спермиях, чтобы прекратить накопление в них вредных продуктов распада.

Состояние, при котором жизненные процессы в спермиях замедляются или полностью приостанавливаются, называется анабиозом. Различают полный анабиоз и неполный.

Когда и где в организме животных возникает неполный анабиоз?

Примером неполного анабиоза можно назвать состояние со спермиями возникающее в придатках семенников. Переходу в анабиотическое состояние здесь способствует слабокислая среда и повышенное осмотическое давление, а также пониженная температура в мошонке (на 3-4°Сниже температуры тела животного). Врезультате анабиоза спермии сохраняют здесь жизнеспособность в течение 1-1,5 мес. Изучение условий хранения спермиев в придатке семенника в значительной мере способствовало успешной разработке методов хранения спермы вне организма.

Добиться замедления обменных процессов в спермиях можно различными способами:

1) путем добавления трилона Б.

2) снижением температуры. При температуре 38-40°Сжизненные процессы протекают с наибольшей скоростью и спермии вне организма быстро погибают. Снижение температуры на каждые 10°Сзамедляет обмен веществ в 2-3 раза и жизнь спермиев значительно удлиняется. 161

Для замедления обменных процессов, необходимо охладить сперму до отрицательных температур. Но, уже при -0,6°Ссперма начинает замерзать, а спермии погибают. Основная причина гибели -кристаллическое замерзание воды в цитоплазме спермиев. Кристаллы льда разрушают тонкую структуру цитоплазмы и ядра, причем, чем крупнее кристаллы, тем больше их разрушительное действие. Поскольку в сперме содержится очень много воды (до 98%), от характера затвердевания последней в основном зависят результаты замораживания.

Однако имеется возможность некристаллического, стеклообразного затвердевания -витрификации -биологических объектов, в том числе и спермиев.

Из курса физики известно, что по мере понижения температуры тепловое движение молекул замедляется, я вязкость воды увеличивается. При достаточно глубоко охлаждении скорость кристаллизационных процессов падает до нуля.

Если сперму охлаждать медленно, то вода, содержащаяся в ней, успеет превратиться в ледяные кристаллы, и спермии погибнут. При очень быстром охлаждении может происходить «стеклообразное» ее затвердевание, без образования кристаллов (витрификация). При витрификации цитоплазма клеток затвердевает как единое целое, без нарушения ее структуры.

Высокие скорости охлаждения достигаются лишь при определенных условиях. Во-первых, нужно охлаждать очень маленькие объемы спермы (порядка 0,1-0,5 мл); при замораживании больших объемов охлаждение замедляется, и в сперме успевает образоваться кристаллический лед. Во-вторых, необходимо использовать охладители с достаточно низкой температурой. Обычно употребляют жидкий азот, имеющий температуру -196°С.

Однако достичь витрификации всего объема замораживаемой спермы, как правило, не удается. Дело в том, что значительная часть воды в сперме (в особенности в плазме спермы) находится в свободном, не связанном состоянии, а для витрификации свободной воды необходимы очень большие скорости охлаждения (порядка нескольких тысяч градусов в секунду), это недостижимо в практических условиях.

Для успешного замораживания спермиев необходимо удалить из их цитоплазмы свободную воду. Сделать это можно воздействием гипертонических растворов. При пониженных температурах, когда спермии находятся в анабиотическом состоянии, их устойчивость к гипертоническим растворам значительно возрастает, особенно в присутствии желтка куриного яйца, который является своеобразным «осмотическим буфером». 162

Если сперму охлаждать с оптимальной скоростью, не слишком медленно и не слишком быстро, то образование кристаллов льда будет происходить сначала в межклеточной жидкости. При вымерзании воды здесь образуются концентрированные растворы сахаров и солей, содержащихся в плазме спермы. Под действием этих растворов из спермиев извлекается свободная вода и остается лишь связанная, которая переходит в стеклообразное состояние, благодаря чему не нарушается структура цитоплазмы.

Сперму перед замораживанием обязательно разбавляют синтетическими средами средами, содержащими желток куриного яйца и глицерин. Желток предохраняет спермии от холодного удара и защищает их от действия концентрированных растворов, образующихся при замерзании воды в плазме спермы.

При введении глицерина понижается точка замерзания спермы, и она становится способной к значительному переохлаждению. Проникая внутрь клеток, глицерин способствует витрификации их цитоплазмы.

Несмотря на то, что для хранения спермы при температуре жидкого азота требуется сложное и дорогостоящее оборудование, этот метод с каждым годом все шире применяется как в нашей стране, так и за рубежом.

При температуре жидкого азота обменные процессы в спермиях замедляются в миллионы раз (а возможно, и полностью приостанавливаются), благодаря чему прекращается «старение» спермиев неминуемо приводящее их к смерти. Находясь в состоянии глубокого анабиоза, спермии могут сохранять свои биологические свойства, в том числе способность оплодотворять яйцеклетки и передавать генетическую информацию, в течение многих лет и даже десятилетий (конечно, при строгом соблюдении правил хранения). Появилась возможность получать потомство от высокоценных животных через много лет после их смерти; для этого достаточно создать запас замороженной спермы при жизни производителя.

В1948 г. И.В. Смирнов впервые осуществил замораживание спермы жеребцов, кроликов, быков и баранов в пакетах их алюминиевой фольги на поверхности твердой двуокиси углерода (-183°). Однако большая часть спермиев погибала, и лишь 5-30% спермиев сохраняли активное поступательное движение. В1950-1951 гг. И.В. Смирнов получил первых ягнят и телят.

Вдальнейшем английские ученые Полдж и Раусон (1952), используя защитное действие глицерина при охлаждении спермиев, разработали пригодный для производства метод длительного хранения спермы быка в жидком азоте (-196°). Внастоящее время 163

этот метод хранения спермы быка широко применяется в России и за рубежом.

Хранение спермы в жидком азоте позволяет значительно улучшить породные качества разводимого скота, так как в тысячи раз увеличивается количество осеменяемых самок спермой ценных производителей. Осеменение коров такой спермой возможно на протяжении ряда лет. У спермы быка, хранящейся в жидком азоте, оплодотворяющая способность остается удовлетворительной на протяжении 25 лет. Метод долговременного хранения спермы значительно увеличивает возможность организации международного обмена спермой выдающихся быков. Для хранения спермы таких быков внутри страны и ее экспорта за последние годы во многих странах организованы специальные «банки спермы».

При длительном хранении спермы в жидком азоте и для ее перевозки необходимо иметь специальное холодильное оборудование: азотно-холодильные камеры, азотные термосы, вакуумные контейнеры и транспортные резервуары.

Кратковременное хранение спермы при температуре, близкой к 0°. Такая температура значительно удлиняет переживаемость спермиев и замедляет обменные процессы; дыхание и гликолиз спермиев у быка и барана тормозятся в 20-25 раз по сравнению с интенсивностью этих процессов при температуре тела животных (Н.П. Шергин).

Для охлаждения спермы используют холодильник, холодильные шкафы или термосы различной конструкции, в которых температура сохраняется около 2-4°. Применение желточных разбавителей значительно повышает устойчивость спермиев к температурному шоку, но полностью не устраняет его. После разбавления спермы, её выдерживают при комнатной температуре (18-20°) 20-30 минут. Затем ампулы, флаконы или пробирки со спермой обвертывают небольшим слоем ваты, помещают в полиэтиленовые мешочки и кладут в холодильник или термос со льдом. Через 30 мин мешочки со спермой укладывают так, чтобы они сверху были закрыты кусочками льда, что обеспечивает необходимую температуру (2-4°). При такой методике хранения сперму быка используют для осеменения коров максимум трое суток с активностью не ниже 7 баллов. Разбавленную сперму барана используют для осеменения овец до 24 ч с активностью не ниже 8 баллов. Сперму жеребца используют для осеменения кобыл после сохранения ее не более двух суток с активностью не ниже 5 баллов.

Впроизводственных условиях для хранения спермы при температуре 2-4° пользуются термосами, сконструированными специально для искусственного осеменения. При хранении спермы решающее значение имеет не конструкция термоса, а постоянство 164

температуры спермы и ограждение ее как от перегревания, так и от переохлаждения и особенно от резких колебаний температуры.