Т.Н. Евстигнеева, Т.А. Кудрявцева

УНИВЕРСИТЕТ ИТМО

Т.Н. Евстигнеева, Т.А. Кудрявцева

ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ

МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОМОДИФИКАЦИИ ПИЩЕВОГО СЫРЬЯ

Учебно-методическое пособие

 

 

Санкт-Петербург

УДК 637.664

Евстигнеева Т.Н., Кудрявцева Т.А. Применение пробиотических микроорганизмов в биомодификации пищевого сырья: Учеб.-метод. пособие.- СПб.: Университет ИТМО, 2016. - 67 с.

 

 

Представлены методические указания к самостоятельной работе магистрантов, выполнению лабораторных работ по дисциплине «Применение пробиотических микроорганизмов в биомодификации пищевого сырья», варианты контрольной работы для магистрантов заочной формы обучения.

Предназначено для магистрантов направления 19.04.01, обучающихся по программе магистерской подготовки «Биотехнология продуктов питания функционального назначения» всех форм обучения.

 

Рецензент: кандидат техн. наук, доц. И.Е. Радионова

 

 

Рекомендовано к печати Советом факультета пищевых биотехнологий и инженерии, протокол № 8 от 25 апреля 2016 г.

Университет ИТМО – ведущий вуз России в области информационных и фотонных технологий, один из немногих российских вузов, получивших в 2009 году статус национального исследовательского университета. С 2013 года Университет ИТМО – участник программы повышения конкурентоспособности российских университетов среди ведущих мировых научно-образовательных центров, известной как проект «5–100». Цель Университета ИТМО– становление исследовательского университета мирового уровня, предпринимательского по типу, ориентированного на интернационализацию всех направлений деятельности.

Ó Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет
информационных технологий, механики и оптики, 2016

 

Ó Евстигнеева Т.Н., Кудрявцева Т.А., 2016

 

ВВЕДЕНИЕ

 

 

Дисциплина «Применение пробиотических микроорганизмов в биомодификации пищевого сырья» относится к вариативной части дисциплин подготовки магистрантов по направлению 19.04.01 Биотехнология. Дисциплина реализуется на факультете пищевых биотехнологий и инженерии Университета ИТМО кафедрой прикладной биотехнологии.

Содержание дисциплины включает спектр вопросов, касающихся роли заквасок в биотехнологических процессах, получения чистых культур заквасочных микроорганизмов, принципов отбора штаммов в состав бактериальных заквасок, обеспечивающих активные биотехнологические процессы производства продуктов функционального назначения, контроля качества бакзаквасок, основных направлений применения пробиотических микроорганизмов при производстве пищевых продуктов на основе животного и растительного сырья.

ОРГАНИЗАЦИЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

СТУДЕНТОВ

Самостоятельная работа студентов – одна из главных составляющих учебного комплекса, определяющего их подготовку. Она организуется самим студен­том. При возникновении сложностей студент обращается за помо­щью к лектору, читающему данный курс.

В самостоятельной работе по изучению дисциплины студент должен руководствоваться настоящим учебным пособием. В нем приведено содержание отдельных разделов изучаемой дисциплины, а также указан объем материала, который должен быть отражен в лек­циях и закреплен на лабораторных работах и практических занятиях. По каждой теме имеются ссылки на литературные источники, приве­дены вопросы для самопроверки.

 

Раздел 1. Характеристика пробиотических микроорганизмов

и их физиологическое влияние на организм человека

 

Введение. Цель и задачи дисциплины. Характеристика пробиотических микроорганизмов и их биологическая роль. Пути поступления пробиотиков в организм человека.

 

Самостоятельная работа студентов – 6 ч:

– работа по теме с литературой – [1], лекционными материа-лами.

 

Вопросы для самопроверки

 

1. Дайте современную формулировку понятию «пробиотики».

2. Какие микроорганизмы можно отнести к пробиотическим?

3. Какова роль пробиотической микрофлоры в организме че-ловека?

4. В чем состоят физиологические функции бифидобактерий в организме?

5. С чем связывают пробиотические свойства молочнокислых бактерий?

6. В чем состоит биологическая роль пропионовокислых бактерий?

7. Каковы пути поступления пробиотиков в организм человека?

 

Раздел 2. Получение заквасочных микроорганизмов

для продуктов функционального питания

 

Источники получения чистых культур микроорганизмов для составления бактериальных заквасок. Принципиальная схема получения бактериальных заквасок. Основные свойства бактериальных заквасок. Виды применяемых заквасок. Способы применения бактериальных концентратов при производстве ферментированных молочных продуктов. Контроль качества заквасок.

Особенности подбора пробиотических микроорганизмов в состав бактериальных заквасок.

Методология получения бактериальных заквасок и бактериальных концентратов со стабильными свойствами.

Использование нетрадиционных источников получения заквасочной микрофлоры для производства кисломолочных продуктов.

 

Самостоятельная работа студентов – 21 ч:

– работа по теме с литературой – [1;2;3], лекционными мате-риалами;

− подготовка к лабораторной работе № 1 «Ознакомление с видовым составом и свойствами бактериальных заквасок, содержащих пробиотические микроорганизмы», оформление отчета;

− подготовка к лабораторной работе № 2 «Определение биотехнологических свойств пробиотических микроорганизмов», офор-мление отчета;

− подготовка к лабораторной работе № 3 «Оценка устойчи-вости заквасочных культур к неблагоприятным факторам культи-вирования», оформление отчета;

− подготовка к практическому занятию № 1 «Особенности селекции штаммов в состав заквасок для производства кисломолочных продуктов функционального назначения»;

− подготовка к практическому занятию № 2 «Определение антагонистической активности заквасочной микрофлоры»;

− подготовка к практическому занятию № 3 «Явление бактериофагии в биотехнологии кисломолочных продуктов»;

− подготовка к практическому занятию № 4 «Методология получения бактериальных заквасок и бактериальных концентратов со стабильными свойствами»;

− подготовка к практическому занятию № 5 «Использование нетрадиционных источников получения заквасочной микрофлоры для производства кисломолочных продуктов».

 

Вопросы для самопроверки

 

1. Укажите источники чистых культур микроорганизмов для составления бактериальных заквасок.

2. Схема селекции различных видов молочнокислых микроор-ганизмов из природных источников.

3. Схема селекции бифидобактерий из природных источников.

4. Основные производственно-ценные свойства бактериальных заквасок.

5. Какие виды бактериальных заквасок применяют при произ-водстве ферментированных молочных продуктов?

6. Способы применения бактериальных концентратов.

7. По каким показателям оценивают качество заквасок?

8. Особенности подбора пробиотических микроорганизмов в состав бактериальных заквасок.

9. Методы определения антагонистической активности мо-лочнокислых бактерий.

10. Методы оценки устойчивости заквасочной микрофлоры к неблагоприятным факторам культивирования.

11. Причины изменчивости свойств культур молочнокислых бактерий.

12. Методология получения бактериальных заквасок и бактериальных концентратов со стабильными свойствами.

13. Приведите примеры использования нетрадиционных источ­ников получения заквасочной микрофлоры для производства кисло­молочных продуктов.

 

Раздел 3. Совершенствование методов селекции заквасочной микрофлоры для пищевых производств

 

Способы улучшения производственно-ценных свойств микро-организмов. Сущность способа применения мутагенного воздействия для усиления биотехнологических свойств заквасочных микроорга­низмов.

Получение улучшенных форм микроорганизмов способом адаптации к режимам культивирования.

Направленное изменение свойств микроорганизмов с помощью генной инженерии.

 

Самостоятельная работа студентов – 10 ч:

– работа по теме с литературой – [1;2], лекционными мате-риалами;

– подготовка к практическому занятию № 6 «Получение производственно-ценных штаммов молочнокислых бактерий путем воздействия мутагенных факторов»;

– подготовка к практическому занятию № 7 «Направленное изменение свойств микроорганизмов с помощью генной инженерии».

 

Вопросы для самопроверки

1. Укажите способы улучшения производственно-ценных свойств микроорганизмов.

2. В чем сущность применения мутагенного воздействия для усиления биотехнологических свойств заквасочных микроорганизмов?

3. Какие химические мутагены Вам известны?

4. Какие физические факторы используются для мутагенного воздействия на заквасочные микроорганизмы?

5. Приведите примеры изменения свойств микроорганизмов в результате мутагенного воздействия.

6. В чем состоит методика получения улучшенных форм микроорганизмов способом адаптации к режимам культивирования?

7. Какова методика направленного изменения свойств микроорганизмов с помощью генной инженерии?

 

Раздел 4. Применение пробиотических культур

в биомодификации животного и растительного сырья

 

Роль микроорганизмов в биотехнологии кисломолочных продуктов. Применение пробиотических микроорганизмов в био-технологии продуктов на молочной основе.

Использование пробиотической микрофлоры для получения продуктов на основе биомодификации сырья в мясной промыш-ленности.

Перспективы применения пробиотиков в производстве продуктов из растительного сырья.

 

Самостоятельная работа студентов – 20 ч:

– работа по теме с литературой – [1;4;5;6;7;8;9;10], лекцион-ными материалами;

− подготовка к лабораторной работе № 4 «Применение заквасок прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами», оформление отчета;

− подготовка к лабораторной работе № 5 «Определение количества жизнеспособных клеток пробиотических культур в кисломолочных продуктах», оформление отчета;

− подготовка к лабораторной работе № 6 «Применение микрофлоры настоя чайного гриба при производстве кисломолочных продуктов», оформление отчета;

− подготовка к практическому занятию № 8 «Технологические аспекты использования бифидобактерий для производства ферментированных продуктов»;

– выполнение реферата.

 

Вопросы для самопроверки

 

1. В чем состоит положительное влияние кисломолочных продуктов на организм человека?

2. Какова роль микроорганизмов в биотехнологии кисло-молочных продуктов?

3. Ассортимент кисломолочных напитков с пробиотической микрофлорой.

4. Каковы технологические аспекты использования бифидо-бактерий для производства кисломолочных продуктов?

5. В чем преимущества использования иммобилизованных пробиотических микроорганизмов при производстве кисломолочных продуктов?

6. Каким методом оценивают количество жизнеспособных клеток пробиотических культур в заквасках и кисломолочных продуктах?

7. Укажите основные направления использования пробиоти-ческих микроорганизмов в мясной отрасли.

8. С какой целью применяют закваски пробиотических культур при производстве колбасных изделий?

9. Приведите примеры применения пробиотиков в производстве хлебобулочных изделий.

 

Самостоятельная работа студентов – 10 ч:

– выполнение реферата;

– подготовка презентации и доклада.

 

Примерные темы рефератов

Требования к микроорганизмам, используемым в качестве основы пробиотических препаратов и продуктов функционального питания.

Подготовка и защита реферата

Объем реферата – не менее 15 страниц. Обязательно использование не менее семи отечественных и не менее трех иностранных источников, опубликованных за последние 10 лет. Обязательно использование электронных баз данных.

Процедура защиты реферата: устная презентация результатов с последующим групповым обсуждением.

По представлении на кафедру реферата, устной презентации на семинаре за работу студента начисляются баллы в зависимости от следующих критериев:

– соответствие содержания заявленной теме, отсутствие в тексте отступлений от темы;

– логичность и последовательность в изложении материала;

– способность к работе с литературными источниками, справоч­ной и энциклопедической литературой, Интернет-ресурсами;

– владение иностранными языками, использование иностранных источников;

– способность к анализу и обобщению информационного мате­риала, степень полноты обзора состояния вопроса;

– наличие авторской аннотации к реферату;

– правильность оформления (соответствие стандарту, структур­ная упорядоченность, ссылки, цитаты, таблицы и т.д.);

– соблюдение объема, шрифтов, интервалов (соответствие оформления правилам компьютерного набора текста);

– владение материалом, правильность ответов на заданные во­просы, способность к изложению собственных мыслей.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ

Каждая работа начинается с рассмотрения ее цели и теорети­ческой части изучаемой темы. Затем дается перечень необходимого оборудования, приборов, материалов, приводятся задания и порядок выполнения лабораторной работы, краткое ее содержание, методы исследования и требования к оформлению. Список рекомендуемой литературы приведен в конце методических указаний.

К работам в лаборатории студентов допускают после их озна­комления с правилами безопасности (с общими – в начале семестра и с частными – перед каждым занятием).

Допуск к выполнению лабораторной работы происходит при условии положительной оценки ответов студентов на устные вопросы, охва­тывающие тему лабораторной работы. Полнота ответов студентов оценивается в баллах.

Студенты, не подготовившиеся к занятию, к выполнению за­дания не допускаются и выполняют его вне расписания после по­вторной проверки готовности.

Отчет по лабораторной работе представляется в рукописном или печатном виде в формате, предусмотренном шаблоном отчета по лабораторной работе (приложение). Защита отчета проходит в форме доклада сту­дента по выполненной работе и ответов на во­просы преподавателя.

Студент полу­чает максимальное количество баллов при оформлении отчета в соответствии с требованиями и правильных ответах на заданные вопросы.

Основанием для снижения количества баллов является:

– небрежное выполнение отчета;

– низкое качество графического материала (отсутствие указания единиц измерения на графиках и т.д.).

Отчет не может быть принят и подлежит доработке в случае отсутствия в нем:

– необходимых разделов;

– необходимого графического материала;

– выводов по результатам работы.

Правила техники безопасности

при работе в лаборатории

 

1. Перед началом занятий необходимо надеть белые халаты.

2. На рабочем месте не следует держать никаких посторонних предметов. Сумки и пакеты укладывают в специально отведенное для них место.

3. Категорически запрещается пить воду из химической посуды, а также пробовать на вкус химические реактивы.

4. Не включать и не выключать без разрешения преподавателя рубильники и приборы. Следить за состоянием изоляции проводов, электроарматуры и оборудования.

5. Горячие и раскаленные предметы ставить только на асбесто­вую сетку или иную термостойкую прокладку.

6. При работе с крепкими кислотами и щелочами необходимо:

а) при отмеривании и переливании кислоты и щелочи надевать защитные очки, резиновые перчатки и поверх халата проре­зиненный фартук;

б) не втягивать кислоту пипеткой в рот, использовать для от­меривания кислоты дозаторы или резиновую грушу;

в) при закрытии жиромеров пробками и при встряхивании за­вертывать их в салфетки;

г) при ввертывании в жиромер резиновой пробки, а также при отсчете показателя содержания жира жиромер держать за расширен­ную часть, завернутую в салфетку;

д) вынимая пробки из жиромеров, держать приборы отверстиями в сторону от себя и от окружающих;

е) отработанные кислоты и щелочи сливать через воронку в специальные бутылки.

7. При попадании на руки или лицо кислоты пораженные места сразу же промыть чистой водой, залить слабым раствором соды и снова чистой водой. Если кислота попала на одежду, ее нейтрали­зуют содой, а затем смывают водой.

8. Если жиромер в центрифуге разбился, необходимо не­медленно промыть диск содовым раствором, чистой водой и проте­реть его насухо.

9. Горящие спиртовки, горелки должны находиться на рас­стоянии не ближе трех метров от воспламеняющихся веществ.

10. При воспламенении горючих жидкостей (бензин, эфир, спирт и др.) следует быстро погасить горелки, выключить электрона­гревательные приборы и принять меры к тушению пожара.

11. По окончании работы привести в порядок рабочее ме- сто (вымыть посуду, поставить на рабочее место реактивы, прибо- ры и т. п.).

 

 

Лабораторная работа № 1

Порядок выполнения работы

Студенты должны исследовать показатели заквасок, перечисленные ниже.

Органолептическая оценка. Сначала оценивают качество закваски по плотности сгустка, а затем перемешивают стерильной палочкой и определяют структуру и аромат исследуемого образца. Полученные данные записывают в таблицу.

Микроскопическая картина закваски. Для приготовления препаратов из штаммов готовой закваски на чистое предметное стекло наносят предварительно прокаленной петлей небольшую каплю закваски и распределяют на площади 1–2 см², стараясь сделать мазок возможно более тонким. Препарат высушивают на воздухе или при слабом нагревании над пламенем горелки. Далее проводят окрашива-ние спирто-водным раствором метиленовой сини. Фиксированный мазок заливают краской и выдерживают в течение 0,5−1,0 мин. После окрашивания смывают краску водой, фильтровальной бумагой удаляют с препарата основную часть воды и окончательно высушивают его над пламенем горелки. Подготовленный таким образом препарат исследуют под микроскопом с иммерсионной системой, устанавливают величину и характер расположения клеток и делают зарисовку микроскопической картины закваски.

Титруемую кислотность закваски определяют по ГОСТ 3624. В колбу вместимостью от 100 до 250 мл вносят 20 мл дистиллированной воды и 10 мл закваски, переносят остатки продукта из пипетки в колбу путем промывания пипетки полученной смесью 3−4 раза. Добавляют три капли фенолфталеина. Смесь тщательно перемешивают и титруют раствором гидроокиси натрия молярной концентрации 0,1 моль/л до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Кислотность, в градусах Тернера (°Т), находят умножением на 10 объема (мл) раствора гидроокиси натрия, затраченного на нейтрализацию кислот, содержащихся в 10 мл закваски.

Интенсивность кислотообразования изучают следующим образом: две пробы молока по 100 мл предварительно пастеризуют при температуре 95 ºС с выдержкой 20−30 мин и охлаждают до температуры 30 и 40 ºС. В охлажденное молоко вносят по 5 мл закваски (5 % от массы заквашиваемого молока) и тщательно перемешивают, после чего помещают в термостат при соответствующей температуре сквашивания (30 и 40 ºС). Пробы исследуют каждый час на протяжении 4−5 часов, измеряя их титруемую кислотность. Для более точного наблюдения за процессом кислотообразования необходимо ставить параллельные пробы образцов. Полученные данные представляют в виде графика зависимости титруемой кислотности от продолжительности сквашивания. Необходимо сделать вывод об оптимальной температуре сквашивания для каждой исследуемой закваски.

Вязкость закваски определяют по продолжительности истечения образца из пипетки вместимостью 100 мл либо с помощью прибора ВКЗ-4 при температуре 20 ºС.

Влагоудерживающие свойства изучают следующим образом: 10 мл исследуемой закваски помещают в мерную пробирку и цен-трифугируют в течение 30 мин, отмечая через каждые 5 мин объем выделившейся сыворотки. По результатам исследования строят график, откладывая по оси абсцисс продолжительность центрифугирования, по оси ординат – объем выделившейся сыворотки (%). Делают вывод о способности сгустков удерживать сыворотку.

Определение ароматобразующих бактерий в закваске проводят по методикам, разработанным лабораторией бактериальных заквасок ВНИИМСа. Наличие в закваске ароматобразующих бактерий можно быстро и достаточно точно определить по продуктам их жизнедеятельности – углекислоте и ацетоину с диацетилом.

Образование углекислого газа. В пробирку диаметром 15 мм наливают 20 мл закваски, отмечают уровень и помещают ее в водяную баню с холодной водой. Температуру воды доводят до 90 ºС и, не вынимая пробирку из воды, отмечают уровень поднятия сгустка. Если закваска содержит углекислоту, то сгусток становится губчатым и приподнимается над сывороткой на 0,6−3 см и более. При отсутствии углекислоты он совсем не приподнимается либо приподнимается незначительно (на 0,3−0,5 см) и не имеет ясно выраженной губчатости.

Определение ацетоина с диацетилом. Закваску фильтруют через бумажный фильтр. Три капли фильтрата смешивают в фарфоровой чашке с тремя каплями 40 %-го раствора КОН. Если в закваске имеется нужное количество ароматических веществ (ацетоин, диаце-тил), то через 10−15 мин появляется ясно выраженное розовое окрашивание. Более позднее розовое окрашивание (через 30 мин и более) во внимание не принимают.

Для упрощения метода вместо фильтрата закваски можно использовать сыворотку, полученную в пробирке при определении углекислоты.

Когда в закваске обнаруживается углекислота, но не обнаруживается ацетоин и диацетил, или наоборот, то такие закваски при всех прочих хороших показателях (продолжительности свертывания, микроскопическому препарату, органолептических свойствах) возможно использовать в производстве, так как эти недостатки могут быть следствием неполноценности молока.

 

Порядок оформления работы

1. Данные, характеризующие закваски по органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям, оформить в виде таблицы.

2. Сделать зарисовки микробиологических препаратов заквасок.

3. Начертить графики, характеризующие интенсивность кислотообразования и влагоудерживающие свойства заквасок.

4. Пользуясь полученными данными, сделать вывод о качестве заквасок, определить, для выработки каких продуктов они предназначены.

Лабораторная работа № 2

Порядок выполнения работы

После получения задания и указаний преподавателя следует четко продумать план выполнения исследований. Целесообразно первоначально приступить к выполнению анализов, требующих больших затрат по времени. В данной работе к таковым относится определение активности испытуемых заквасок по продолжительности сквашивания.

Свежеприготовленные испытуемые закваски оцениваются по внешнему виду, органолептическим показателям, кислотности, а также по составу и количеству клеток путем приготовления и просмотра микроскопического препарата под микроскопом. При этом следует руководствоваться требованиями к качеству заквасок, предписанными действующей в отрасли нормативной документацией («Технологическая инструкция по приготовлению и применению зак-васок и бактериальных концентратов для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности»).

После оценки качества сырья, органолептических и физико-химических показателей закваски приступают к определению активности, энергии и предела кислотообразования испытуемых заквасок.

Подготовку сырья для этих анализов следует проводить одновременно в одной емкости, в объеме, суммарно соответствующем массе сырья для трех анализов. Молоко пастеризуют при температуре 92−95 °С в течение 30 мин; охлаждают до температуры заквашивания, соответствующей виду испытуемой закваски, разливают в подготовленные стерильные промаркированные баночки и вносят испытуемые закваски в количестве 5 % от объема сырья (по четыре баночки для каждого вида закваски). Затем баночки с заквашенным молоком помещают в термостат с требуемой температурой, размещая их в три группы по виду анализа, и термостатируют.

В первой группе каждый вид закваски представлен в двух параллельных образцах. Один предназначен для определения динамики кислотонакопления, а другой − для получения характеристики образуемого сгустка.

Для определения интенсивности кислотонакопления отбирают пробы (из образцов первой группы) после заквашивания, затем через 2 ч термостатирования и далее через каждые 30 мин до момента образования сгустка.

Для более точного определения момента окончания сквашивания к концу процесса интервалы между отбором проб целесообразно сократить до 10−15 мин. Продолжительность сквашивания фиксируют в отчете о лабораторной работе.

В готовых сгустках (из параллельных образцов каждого вида закваски) оценивают внешний вид, вкус и запах, консистенцию, влагоудерживающую способность, наличие ароматобразования и микроскопическую картину.

Для изучения энергии кислотообразования пробы на анализ кислотности отбирают из второго ряда образцов через 24 ч сквашивания. Перед отбором пробы следует оценить внешний вид полученного сгустка, затем перемешать 5−7 раз и далее отобрать пробу и выполнить анализ.

Для определения предела кислотообразования образцы третьего ряда выдерживают в термостате до трех суток культивирования. Оценку показателей проводят так же, как и при определении энергии кислотообразования.

Порядок оформления работы

1. Привести данные, характеризующие биотехнологические показатели испытуемых заквасок в виде таблиц, форма которых представлена в табл. 1, 2, 3.

2. Зарисовать микроскопические картины препаратов исходных заквасок и молочных сгустков.

3. Провести анализ полученных результатов и сделать выводы о соответствии испытуемых культур требованиям, предъявляемым к закваскам для получения кисломолочных продуктов.

 

Таблица 1

Лабораторная работа № 3

Методы исследования

Устойчивость молочнокислых палочек к фенолу. К 10 мл стерилизованного обезжиренного молока добавляют 0,5 мл 8 %-го раствора фенола. Пробирки с молоком и фенолом тщательно встряхивают, засевают исследуемым штаммом термофильных молочнокислых палочек (1 капля) и помещают в термостат, где выдерживают до 48 ч при температуре 37 °С.

Образование сгустка в молоке через 24 ч указывает на высокую устойчивость выделенного штамма к фенолу. Штаммы, свертывающие молоко менее чем за 48 ч, являются также устойчивыми к фенолу. Штаммы, не свертывающие молоко в течение 48 ч, выбраковывают.

Устойчивость мезофильных лактококков к фенолу. Для определения устойчивости мезофильных лактококков отбирают две пробы свежего пастеризованного молока по 100 мл, в которые вносят по 2 мл исследуемого штамма. Кроме того, в одну пробу добавляют 2 мл 10 %-го раствора фенола.

Пробы термостатируют при температуре 30 °С в течение 6 ч, после чего в обеих пробах определяют титруемую кислотность. По разности в кислотности первой и второй проб судят об отношении штаммов к фенолу. Устойчивые к фенолу (0,2 %) штаммы имеют разницу в кислотности в пределах 4−10 °Т, а чувствительные − 36−46 °Т.

Устойчивость мезофильных лактококков к пенициллину. Для определения устойчивости мезофильных лактококков к пенициллину отбирают две пробы свежего пастеризованного молока по 100 мл, в которые вносят по 2 мл исследуемого штамма. Кроме того, в одну пробу добавляют пенициллин из расчета 0,05 МЕ/мл. Пробы термостатируют при температуре 30 °С в течение 6 ч. По разности в кислотности первой и второй проб судят об отношении штаммов к пенициллину. Устойчивые штаммы имеют разницу в кислотности до 10 °Т, а чувствительные − более 30 °Т.

Устойчивость молочнокислых бактерий к желчи. В гидролизованное молоко, содержащее желчь (рН 6,8−7,0), засевают исследуемую культуру (1 петля на 8−10 мл среды).

Мезофильные лактококки высевают на среду с 20, 30 и 40 % желчи; термофильные стрептококки – на среду с 20 и 30 % желчи. Термофильные молочнокислые палочки испытывают на среде, содержащей 20 и 40 % желчи. Посевы выдерживают в термостате при температуре 30 °С (при исследовании мезофильных лактококков) или при 40−42 °С (при исследовании термофильных молочнокислых бактерий) в течение 48 ч. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности. Посевы также контролируют выборочно по микроскопическому препарату.

Устойчивость молочнокислых бактерий к поваренной со-ли. Исследуемую культуру засевают в количестве 1 петли на 8−10 мл гидролизованного молока (рН 6,8−7,0) с различным содержанием соли.

Штаммы мезофильных лактококков высевают в среду, содержащую 2, 4 и 6,5 % NaCl, штаммы термофильных стрептококков и термофильных молочнокислых палочек – на среду с 2 и 4 % NaCl.

Посевы выдерживают в термостате при температуре 30 °С (при исследовании мезофильных лактококков) или при 40−42 °С (при исследовании термофильных молочнокислых бактерий) в течение 48 ч. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности. Посевы также контролируют выборочно по микроскопическому препарату.

Устойчивость молочнокислых бактерий к щелочной реак-ции среды. В мясопептонный бульон с 2 % дрожжевого автолизата с определенным рН засевают исследуемую культуру (1 петля на 8−10 мл среды). Мезофильные лактококки засевают в среды с рН 9,2 и 9,6). Термофильные молочнокислые палочки испытывают на среде с рН 8,3.

Посевы выдерживают в термостате при температуре 30 °С (при исследовании мезофильных лактококков) или при 40−42 °С (при исследовании термофильных молочнокислых палочек) в течение 48 ч. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности. Посевы также контролируют выборочно по микроскопическому препарату.

Порядок выполнения работы

В ходе выполнения лабораторной работы студенты должны:

– ознакомиться с сущностью и порядком проведения исследования;

– провести высев штаммов микроорганизмов в питательные среды;

– провести термостатирование пробирок и колб с засеянной культурой;

– провести учет результатов.

– оформить отчет по результатам лабораторной работы.

 

Лабораторная работа № 4

Порядок выполнения работы

 

Получив задание, студенты должны выполнить работу следующим образом:

– проверить показатели качества свежеприготовленных кисломолочных продуктов, подлежащих обогащению (органолептические показатели, титруемую кислотность, вязкость по времени истечения, характер микрофлоры путем просмотра микроскопического препа-рата);

– оценить микроскопический препарат свежеприготовленной жидкой закваски бифидобактерий;

– приготовить растворенную культуру DVS из лиофилизиро-ванного бактериального концентрата и определить ее показатели качества;

– рассчитать объем растворенной культуры для обогащения продукта исходя из массы обогащаемого продукта и заданной массы вносимой культуры;

– провести технологическую операцию «обогащение»;

– оценить качество готового «биопродукта» (органолептические показатели, кислотность, вязкость истечением, характер микрофлоры по микроскопическому препарату);

– обсудить полученные результаты, оформить отчет о выполнении работы, сделать выводы.

 

Обогащение культурой DVS

Выполнение работы начинается с оценки качества обогащаемых продуктов и подготовки лиофилизированной культуры DVS.

При использовании заквасок прямого внесения DVS (лиофили-зированного бактериального концентрата) необходимо строго соблюдать рекомендации по их применению.

Следует отметить, что упаковки культур DVS рассчитаны на использование в производственных условиях для больших объемов выпускаемой продукции (от 500 –1000 литров) и содержат стандартное количество культуры в условных единицах активности (50; 200; 500 ед.).

При необходимости выработок в малых объемах (в том числе предварительные испытания заквасок и, в нашем случае, в учебных целях) следует применять следующую методику, предложенную фирмой − изготовителем заквасок с использованием упаковки для минимального объема (50 ед.).

Методика основана на приготовлении растворенной культуры DVS и сводится к следующему. Порцию стерилизованного молока (1000 мл) подогревают до температуры заквашивания (в условиях, близких к стерильным). Затем берут упаковку DVS культуры активностью 50 ед., протирают тампоном, смоченным спиртом, край пакета, вскрывают предварительно профламбированными ножницами и вносят в подготовленное молоко. Тщательно перемешивают стерильной мутовкой (ложкой, мешалкой) до полного растворения культуры и отбирают требуемый объем растворенных культур DVS соответственно массе обогащаемого продукта по схеме, приведенной в табл. 4.

 

Таблица 4

Лабораторная работа № 5

В КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

Цель работы: усвоить методику количественного учета жизнеспособных клеток бифидо- и лактобактерий в кисломолочных продуктах, обогащенных пробиотиками.

 

В последние десятилетия как в нашей стране, так и в зарубежных развитых странах значительно увеличился спрос на кисломолочные продукты и, в первую очередь, на продукты с пробиотическими свойствами. Это объясняется высоким оздоровительным эффектом на организм человека содержащихся в продуктах пробиотиков, т. е. микроорганизмов, относящихся к нормофлоре кишечника.

Многочисленными исследованиями показано, что регулярное потребление в рационе питания пробиотиков приводит к укреплению здоровья. На оздоровительный эффект существенно влияет концентрация жизнеспособных клеток пробиотиков. Для достижения должного эффекта в укреплении здоровья необходимо, чтобы содержание в продуктах клеток пробиотиков было не менее 10⁶ в 1 см³ для бифидобактерий и 10⁷ в 1 см³ − для лактобактерий. Поэтому современная нормативно-техническая документация предусматривает показатель, характеризующий важнейшее свойство данной продукции, – коли-чество жизнеспособных клеток пробиотика (бифидо- и лактобактерий) в конце срока годности продукта, КОЕ/см³.

Для определения этого показателя были разработаны и введены в действие методы контроля, осуществляемые в соответствии с инструкцией по микробиологическому контролю производства. Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах проводят в соответствии с МУК 4.2.999−00, а количества молочнокислых микроорганизмов − в соответствии с ГОСТ 10444.11−89.

Данная лабораторная работа и предусматривает практическое ознакомление с методикой кол