Методы изучения конформационной подвижности: изотопный обмен, люминесцентные методы, спиновая метка, гамма-резонансная метка ЯМР высоко разрешения, импульсные методы ЯМР.

Метод изотопного обмена. Исторически возникновение понятия о конформационной подвижности белков связано с развитием метода изотопного обмена атомов водорода. Явление изотоп­ного обмена состоит в том, что атомы водорода, входящие в основном в амидные пептидные группы, могут вступать в обратимую реакцию обмена с атомами дей­терия и трития, находящимися в окружающем растворителе. Метод изотопного обмена дает уникальную возможность регистрировать ничтожные концентрации конформационно неравновесных состояний. Но он не позволяет установить, какая часть молекулы белка и каким образом должна перестроиться, чтобы ее NH-группы оказались доступными растворителю.

Этим методом нельзя определить частоту конформационных движе­ нии, которая представляет собой важную характеристику внутримолекулярной по­ движности белка. Ценность метода изотопного обмена определяется информацией о локальных конформационно неравновесных состояниях, которые, накапливаясь в достаточных концентрациях, могут способствовать конформационным переходам, сопровождающим функциональные процессы в белках. Сегодня люминесцентные анализ охватывает широкий круг методов определения разнообразных объектов от простых ионов и молекул до высокомолекулярных соединений и биологических объектов. Детектируется люминесценция самого объекта или его производных, возможно также использование изменения люминесценции специфичных агентов. Для сложных проб люминесцентное детектирование сочетается с химическим разделением (хроматография, электрофорез) или с биологическим выделением (иммуноанализ, метод полимеразной цепной реакции - ПЦР).

Процесс люминесценции включает в себя переход молекул на возбужденный электронный уровень, колебательную релаксацию в возбужденном состоянии, переход на основной электронный уровень либо с испусканием света (собственно люминесцентное излучение), либо безызлучательно и колебательной релаксации в основном состоянии.

Спиновая метка. Суть метода: Присоединение к функц-ой группе белка свободного радикала и изучения хар-к его сигналов ЭПР. Наиболее удобны в этом отн-ии нитроксильные радикалы, сод-ие свободнорадикальную группу N-О. Неспаренный электрон прин-т 2p-орбиталям N и О2 и фактически делакализован м\ду атомами Nи О, эф-но взаимодействуют по диполь-дипольному механизму с магнитным моментом спина ядра атома азота.

В силу этого проис­ходит расщепление линии поглощения сигнала ЭПР (СТС) на три составляющие, соответствующее трем разным проекциям ядерного спина азота на направление Но. Вид спектра определяется главным образом анизотропным взаимодействием. Гамма-резонансная метка. Этот метод дает важную информацию о динамике белков. Он позволяет определять амплитуды смещений атомов в струк­туре белка на коротких временах (10-7-10-9 с).

Он основан на том, что при поглощении у-кванта происходит переход ядра из основного (Е\) в возбужденное состояние (Е-2) согласно обычному закону ∆Е = Е2 — Е1 = hv, где для ядерных уровней ∆Е составляет 103-105 эВ. Поглощение у-квантов наблюдается на ядрах тяжелых атомов Fe, Cu, Pb. Для изотопа 57Fe, содержащегося в природных соеди­нениях в количестве 2,2%, величина ∆Е при резонансном поглощении составляет 14,4 КэВ, а время жизни ядра 57Fe в возбужденном состоянии τ* ~ 10 -7 с. Отсюда согласно соотношению неопределенностей для энергии можно найти, что естественная ширина резонансной линии поглощения у-квантов составляет очень малую величину Г ~ 10 -8 эВ. Спектры ЯГР (ядерного гамма-резонанса) отражают химическую и физиче­скую структуру окружения ядра и характеризуются химическим сдвигом, квадру-польным расщеплением, формой линии и сверхтонкой структурой.

В настоящее вре­мя ЯГР становится мощным орудием в расшифровке атомной структуры активных центров. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Одним из мощных методов изучения динамики биополимеров является метод ядерного магнитного резонанса. Сущность явления ЯМР сходна в основных чертах с электронным парамагнитным резонан­сом. Ядра (помимо ядер с четным числом протонов и нейтронов), к числу которых принадлежат основные изотопы углерода 612С и кислорода 816О), имеют отличные от нуля значения спина І (принятое для ядер обозначение) и магнитного дипольного момента.

При этом магнитные моменты разных ядер отличны друг от друга. Условия резонанса для ядер, например протонов, входящих в состав молекул, будут отличаться от условий для свободного протона вследствие экранирования электронными оболочками и влияния ядер химического окружения протона. Поэтому резонансное магнитное поле в должно быть заменено эффективным полем, учитывающим влияние окружения. Кроме того, магнитные моменты различных ядер взаимодействуют между собой и электронами в молекуле, причем характер этого взаимодействия также зависит от окружения ядра. Эти факторы влияют на параметры спектра ЯМР, давая тем самым информацию о химических свойствах и внутримолекулярной динамике образца.

Импульсные методы ЯМР. основаны на том, что система спинов, ориентиро­ванных в постоянном внешнем магнитном поле, возбуждается импульсом радиоча­стотного поля и выводится тем самым из равновесия. Это приводит к отклонению вектора микроскопической намагниченности от его первоначальной ориентации вдоль направления поля Но В результате система ядерных спинов начинает прецес-сировать вокруг Но, наводя ЭДС в приемной катушке, что регистрируется в виде сигнала свободной индукции после окончания радиочастотного импульса. Сигнал свободной индукции представляет фурье-отображение спектра, по которому мо­жет быть восстановлен и сам спектр после соответствующей обработки с помощью ЭВМ. Этот метод позволяет резко ускорить регистрацию спектров и его широко применяют в современных спектрометрах ЯМР.

Таким образом, метод ЯМР позволяет идентифицировать определенные ви­ды внутримолекулярного движения в молекуле белка. Все это дает возможность осуществлять прямые экспериментальные исследования связи между внутренней динамикой и функцией белковых молекул.

29. Химические реакции полимеров включают взаимодействие полимерной макромолекулы с низкомолекулярным соединением, взаимодействие между собой функциональных групп внутри одной макромолекулы, взаимодействие друг с другом двух макромолекул, разрушение (распад) макромолекулы на более мелкие образования.

Уже эта простая классификация показывает, что химические реакции полимеров существенно отличаются от реакций низкомолекулярных соединений. Достаточно достоверно установлено, что реакционная способность функциональных групп не меняется в зависимости от того, содержатся ли они в обычных молекулах или в составе макромолекулярной цепи. Если скорость диффузии низкомолекулярного компонента в полимере не является лимитирующим фактором, то скорость химической реакции определяется соударениями реагирующих частиц. Величины энергии активации реакций соответствующих функциональных групп в высокомолекулярных и в низкомолекулярных соединениях одинаковы. Это подтверждается рядом реакций гидролиза, ацетилирования и др.

Однако влияние высокомолекулярной природы вещества на протекание реакций все же сказывается. Рассмотрим кратко наиболее важные отличия реакций полимеров от соответствующих реакций низкомолекулярных соединений. Реакционная способность функциональных групп в макромолекуле может измениться, если одна из соседних групп уже прореагировала с каким-либо низкомолекулярным реагентом, а другая - нет, поскольку при этом в цепи возникает инородность. Так, если реагируют низкомолекулярные спирт и кислота, то образуется сложный эфир определенного строения. Если же реагирует, например, полиакриловая кислота с низкомолекулярным спиртом или поливиниловый спирт с низкомолекулярной кислотой, то в каждый момент времени в цепях будут содержаться и сложноэфирные, и непрореагировавшие кислотные или гидроксильные группы в разных соотношениях. Это приведет к различию свойств продуктов этерификации на разных стадиях реакции, так как реакционная способность соседних функциональных групп может понижаться или повышаться от наличия прореагировавшей группы (так называемый «эффект соседа»).

Различная конфигурация расположения звеньев в макромолекулах одного и того же химического строения также может менять скорость химических реакций. Например, скорость кислотного гидролиза изотактического полиметилметакрилата более чем вдвое превышает скорость гидролиза синдиотактического полиметилметакрилата. Это обусловлено разным пространственным расположением сложноэфирных групп этих полимеров: у изотактического полимера они находятся в одной плоскости. Образующаяся при гидролизе карбоксильная группа катализирует гидролиз соседней эфирной группы, так как при этом возникает промежуточное комплексное соединение. В синдиотактическом изомере геометрия расположения сложноэфирных групп не позволяет образоваться такому комплексу:

о - Н, о - С, О - СНз, О - СООСНз

Большое влияние на скорость химических реакций в полимерах оказывает форма макромолекулы, а также образование вторичных (надмолекулярных) структур при агрегировании макромолекул. При этом может замедляться скорость диффузии низкомолекулярных реагентов, и реакция проходит только по границе раздела отдельных надмолекулярных структур. Если же реакция идет в растворе полимера, то свернутая или выпрямленная форма макромолекулы соответственно затрудняет или облегчает вероятность столкновения реагента с функциональными группами макромолекул.

Наконец, у полимеров могут осуществляться реакции, которые неизвестны в низкомолекулярной химии. Это, например, разрыв длинных макромолекул на более короткие (деструкция цепи), образование сетки из многих макромолекул, сшитых в разных местах с помощью какого-либо химического вещества или физического воздействия (пространственно-сшитые полимеры).

Если при химических реакциях полимеров не происходит изменения длины макромолекулы, а образуются только новые функциональные группы на той же макромолекуле, то такие превращения называются полимераналогичными. Если же длина цепи в результате реакции изменяется, т. е. протекает деструкция, сшивание, разветвление или циклизация цепей, то эти превращения относятся к категории внутри -
или межмолекулярных взаимодействий, приводящих к образованию более низкомолекулярных или высокомолекулярных, линейных или нелинейных полимеров, а также сшитых (сетчатых) полимеров.

 

Связывающие и разрыхляющие орбитали Исходное энергетическое состояние в атомах вырождено, но при соединении атомов в молекулу оно расщепляется на два новых энергетических состояния: одно с более низкой, а другое с более высокой энергией, чем исходное атомное состояние. Схематично это показано на рис. 1. Рисунок 1. Комбинации двух атомных орбиталей с образованием двух молекулярных орбиталей По терминологии теории молекулярных орбиталей, орбиталь, которой соответствует меньшая энергия, называется связывающей, орбиталь с большей энергией называется разрыхляющей. Для любого расстояния между ядрами можно вычислить общую энергию молекулы; полученная зависимость носит название кривой потенциальной энергии молекулы (рис. 2). На кривой имеется минимум («яма»), соответствующий стабильному состоянию молекулы с межъядерным расстоянием Rравн, которое носит название равновесной длины связи (или просто длины связи; например, в рассматриваемом выше ионе Н р а в н Å Н2+⋅Rравн=1.06Å).

Орбиталь является связывающей или разрыхляющей молекулярной орбиталью в соответствии с определениями: Молекулярная орбиталь называется связывающей, если заселение ее электронами приводит к понижению общей энергии молекулы. Молекулярная орбиталь называется антисвязывающей (разрыхляющей), если заселение ее электронами приводит к повышению общей энергии молекулы.

Энергия делокализации я-электронов выражается в энергетических единицах р. Количественно Р равна 18—20 ккал. Энергия делокализации двух я-электронов в двойной связи типа этилена равна 2р. Следовательно, любая кекулевская структура бензола с тремя двойными связями должна обладать энергией делокализации электронов бр. Однако расчеты по методу МО для взаимодействия я-электронов в бензоле дают энергию, равную Вр. Избыток энергии в 2р должен быть результатом делокализации двойных связей. В основном со- [c.36]

    Подобное положение возникает в самом общем случае и экспериментально определяемая энергия делокализации электронов или энергия резонанса будет содержать долю, обусловленную изменениями гибридизации. Эта доля энергии, связанная с изменениями гибридизации, дается уравнением [c.82]

30. Принцип Франка – Кондона: электронные переходы в молекулах происходят очень быстро (около 10 в -15 с) по сравнению с движением ядер, благодаря чему расстояние между ядрами и их скорости при электронном переходе не успевают измениться. Существует несколько дополнительных формулировок этого принципа: электроны не обмениваются энергией с ядрами; электроны всегда имеют равновесную конфигурацию при любом расположении ядер. Зависимость потенциальной энергии системы от координат ядер многоатомной молекулы в основном и возбужденном состояниях различается. В наиболее простом случае (двухатомная молекула) минимумы кривых потенциальных энергий в основном и возбужденном состояниях сдвинуты, поскольку орбиталь, заполняемая электроном в возбужденном состоянии, занимает большую область пространства, чем в основном состоянии, и положение равновесия в возбужденном состоянии, следовательно, соответствует большему межъядерному расстоянию (поэтому сдвиг). Кроме того, форма таких потенциальных кривых в основном и возбужденном состояниях также различается.

В соответствии с принципом Франка — Кондона наиболее вероятным будет такой переход, при котором не произойдет изменений ни в положении ядер, ни в импульсе (принцип вертикальности перехода между двумя электронными состояниями). Решение волнового уравнения показывает, что хотя при поглощении кванта света возможны различные переходы, однако наиболее вероятным будет переход, обозначенный сплошной стрелкой вверх на рис. 2. Иными словами, наиболее вероятное межъядерное расстояние для молекулы с нулевой колебательной энергией соответствует середине АВ. В случае флуоресценции наиболее вероятным будет испускание из середины CD (сплошная стрелка вниз), что соответствует наиболее интенсивной полосе спектра. Флуоресценция происходит с самого нижнего колебательного уровня первого возбужденного состояния при переходе молекулы в основное состояние. Вероятность перехода из возбужденного в основное состояние может быть описана константой скорости перехода k, которая по физическому смыслу эквивалентна константе мономолекулярной реакции. Кинетика перехода может быть описана реакцией первого порядка dS*/dt=-kS*, где S* - количество возбужденных молекул. После интегрирования волшебным образом I=Io*exp(-kt), k – константа флуоресценции.

При отсутствии безызлучательных процессов (фи= 1) длительность пребывания молекулы в возбужденном состоянии определяется радиационным, или естественным, временем жизни тау0=1/константу флуоресценции. Это то время, в течение которого число возбужденных молекул уменьшается в e раз. В реальных ситуациях квантовый выход обычно меньше единицы, поскольку с флуоресценцией конкурируют безызлучательные процессы: интеркомбинационная конверсия с переходом в триплетное возбужденное состояние, сопровождающееся изменением спина, внутренняя конверсия, диссипация в тепло, фотохимическая реакция или дезактивация за счет тушения флуоресценции при взаимодействии с молекулами тушителя Q.

В действительности квантовый выход флуоресценции меньше единицы вследствие существования в молекуле безызлучательных процессов; следовательно, реальное (или измеряемое) время жизни тау флуоресц окажется меньше тау): 1/сумму констант происходящих процессов (флуоресценция, фотосинтез, интеркомбинационная конверсия в триплетное состояние, диссипация в тепло (внутренняя конверсия), тушение*[Q]). Квантовый выход флуоресценции в этом случае выражается соотношением: фи=константа флуоресценции/сумму констант происходящих процессов, т.е. Фи=константа флуоресценции*время жизни.

В отсутствие тушителя квантовый выход флуоресценции обозначают как фи фл0. Фи фл0/фи фл= 1 + константаq*[Q])/сумму всех констант без тушителя, то, обозначив время жизни в отсутствие тушителя через тау фл0 (не путать с тау0 которая вообще без побочных процессов), получим, что тау фл0 =1/ сумму всех констант без тушителя и (фи фл0/фи фл) – 1 = тау фл0* константаq*[Q]=K[Q]. I=I0/(1+ K[Q]). Последнее уравнение называется соотношением Штерна и Фольмера, а К — константой тушения. Последняя легко определяется экспериментально при измерении интенсивностей флуоресценции различных образцов, отличающихся концентрацией тушителя. Для этого достаточно оценить угловой коэффициент прямой в координатах I без тушителя/(Iс тушителем - 1) и [Q].

Исходя из определения квантового выхода флуоресценции фи=I фл/(I0-Iпрошедшего через объект), с использованием закона Ламберта — Бэра можно установить связь между интенсивностью флуоресценции I и молярным коэффициентом поглощения, а также концентрацией с: I=K*I0*(1-Т)*фи, где I0— интенсивность возбуждающего света, (1 — Т) — величина поглощения, Т — величина пропускания, К — коэффициент пропорциональности, зависящий от способа измерения.

Так как D= - lg Т = эпсилон*с1, где D — оптическая плотность, то I=K*I0*(1-10 в степени -D)*фи. Выражение в скобках можно разложить в ряд при небольших значениях D и ограничиться линейным членом: I примерно=2,3K*I0*эпсилон*cl*фи

Это означает, что при малых оптических плотностях (меньше 0,1-0,2) I пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества и интенсивности возбуждающего света.

Точное измерение интенсивности флуоресценции осложняется целым рядом факторов: реабсорбцией флуоресценции, экранированием возбуждающего света другими молекулами, светорассеянием, гетерогенностью объекта, миграцией энергии, тушением флуоресценции. При комнатной температуре квантовый выход флуоресценции хлорофилла в нативных фотосинтетических мембранах составляет не более 3%. Низкотемпературная техника может ослабить влияние возбуждающего света, вызывающего побочные процессы. Флуоресценция хлорофилла в нативных фотосинтетических мембранах продуцируется молекулами хлорофилла антенны и при комнатной температуре характеризуется главным максимумом 684-687 нм и «плечом» в более длинноволновой области около 720-730 нм. В случае целых листьев из-за реабсорбции доля длинноволновой полосы возрастает. При комнатной температуре квантовый выход для фотосистемы 1 в несколько раз меньше, чем для фотосистемы 2.

Люминесценция — «холодное» свечение некоторых веществ (люминофоров); излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при данной температуре и имеющее длительность, значительно превышающую период световых волн. Характеристики: спектр возбуждения, спектр люминесценции, квантовый выход, время жизни молекулы в возбужденном состоянии. Она делится на уже описанную флуоресценцию (быструю люмин) и фосфоресценцию (медленную люмин). Фосфоресценция – переход с нижнего колебательного уровня триплетного состояния T1 на основное возбужденное (время жизни возбужденного состояния при фосфоресценции составляет порядка 10 в −2 – 10 в −4 с, т.к. синглет-триплетные переходы имеют квантово-механический запрет – так может делать хлорофилл). Механизмы миграции хорошо отражает рис 3 и описанные ранее процессы.

Рис. 3. Схематическое изображение физического механизма люминесценции: жирными горизонтальными линиями обозначены энергетические состояния молекулы люминесцирующего вещества; S0 — основное (невозбужденное) состояние; S2, S2 и Т1 — возбужденные состояния; тонкими горизонтальными линиями обозначены колебательные уровни (0, 1, 2.,. или 0’, 1’, 2’ и т.д.); в прямоугольниках показано направление спина возбужденного электрона (слева) по отношению к спину оставшегося электрона; ВК — внутренняя конверсия (переходы электрона без обращения спина); ИК — интеркомбинационная конверсия (переходы электрона с обращением спина). При поглощении энергии молекула переходит в возбужденное состояние S1 или S2 (обозначено синими вертикальными стрелками). Часть поглощенной энергии преобразуется в тепло (обозначено волнистыми стрелками), при этом молекула переходит на нижний колебательный уровень состояния S1 или трансформируется в состояние Т1 Возвращение молекулы из состояния S1 или Т1 на исходный энергетический уровень может сопровождаться излучением света — флюоресценцией (обозначена темно-зелеными стрелками) или фосфоресценцией (обозначена светло-зелеными стрелками).

Люминесценция биологических объектов может быть собственной (первичной) либо возникать после соответствующей химической модификации имеющихся веществ (вторичная), а также после введения так называемых флюоресцентных зондов.

Флюоресцирующие соединения могут быть определены в очень низких концентрациях, часто в присутствии посторонних веществ. Поэтому регистрация люминесценции успешно используется для количественного определения многих биологически важных веществ. Одним из наиболее ярко флюоресцирующих лекарственных соединений является хинин. В кислых растворах он люминесцирует в синей области (450—475 нм). Чтобы определить его в плазме крови проводят осаждение белков метафосфорной кислотой и измеряют люминесценцию хинина прямо в фильтрате. Яркой синей флюоресценцией обладает противогрибковый препарат гризеофульвин, он легко определяется в экстрактах из крови или мочи. Барбитураты в щелочной среде обладают яркой зеленой флюоресценцией, их можно определить в экстрактах из биологического материала. После экстракции возможна количественная регистрация многих витаминов, например витамина Е, максимум флюоресценции которого лежит в УФ-области при 330 нм. Витамин В6 имеет синюю, а витамин А — зеленую флюоресценцию. Витамины С, D, В12 и др. удается определить по вторичной люминесценции. Наркотические вещества морфин и героин флюоресцируют очень слабо, но после обработки образцов серной кислотой с последующим выщелачиванием возникает специфическая интенсивная синяя флюоресценция продуктов реакции. Этим методом удается определить до 0,02 мкг наркотика в пробе. Чувствительным лабораторным методом определения АТФ является регистрация хемилюминесценции в присутствии люциферина и люциферазы светлячка. Люцифераза катализирует реакцию восстановленного люциферина с АТФ; продукт этой реакции — аденилат при окислении испускает свет. По собственной люминесценции проводят контроль качества пищевых продуктов. Так, при длительном хранении молока и сливок рибофлавин окисляется в люмихром, что сопровождается изменением цвета флюоресценции от желто-зеленого к синему. Яйца, зараженные некоторыми видами бактерий рода Pseudomonas, при УФ-облучении начинают интенсивно флюоресцировать (за счет пигмента пиовердина, синтезированного этими бактериями).

Регистрацию люминесценции используют в целях диагностики. Характерная первичная люминесценция желто-зеленого цвета, возбуждаемая УФ-облучением при 365 нм, наблюдается в волосах, пораженных паразитическими грибками.

Регистрация люминесценции позволяет получать важную информацию о физико-химических свойствах биологических объектов в норме и патологии. Молекулярные механизмы работы цепи переноса электронов в митохондриях, целых клетках и даже в тканях изучают по изменению синей (440 нм) флюоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов, возбуждаемой при 365 нм. При изучении структуры нуклеиновых кислот применяют акридиновый оранжевый и другие зонды. При этом определение положения максимума люминесценции в спектре позволяет судить о структуре нуклеиновой кислоты. Так, максимум акридинового оранжевого и двуспиральной нативной ДНК располагается в зеленой области спектра (530 нм), тогда как в одноцепочечной ДНК и РНК он смещается в красную область (640 нм). Микрофлюориметрически с помощью зондов анализируют ДНК непосредственно в клетках. В медицинской технике распространение получили неорганические люминофоры — вещества, способные к фото-, рентгенофлюоресценции и т.д.

Биолюминесценция – видимое свечение организмов, связанное с процессами их жизнедеятельности; являет собой результат биохимической реакции, в которой химическая энергия возбуждает специфическую молекулу, и та излучает свет. Наблюдается у нескольких десятков видов бактерий, низших растений (грибов), у некоторых беспозвоночных животных (от простейших до насекомых включительно), у рыб. Светящиеся организмы иногда размножаются в таком количестве, что вызывают свечение моря. У многих организмов (бактерии, простейшие, ракообразные, грибы и др.) свечение происходит постоянно и непрерывно, если в окружающей среде есть кислород. У других биолюминесценция происходит отдельными вспышками и связана с условиями жизнедеятельности (голод, период размножения и др.). Биологическое значение биолюминесценции различно. Так, у светящихся насекомых вспышки биолюминесценции служат сигналом, позволяющим самцам и самкам находить друг друга; у ряда глубоководных рыб — для освещения и приманки добычи; у каракатицы — для защиты от хищников (путём выбрасывания светящейся жидкости) и др. В некоторых случаях источником биолюминесценции животного являются светящиеся бактерии-симбионты (например, т. н. несамостоятельное свечение ряда рыб).

31. Перенос электрона в биоструктурах происходит на большие расстояния без непосредственного контакта донора и акцептора электрона. В митохондриях и хлоропластах именно электронный транспорт лежит в основе важнейших энергетических процессов— дыхания и фотосинтеза. В этих органеллах расстояния между различными простетическими группами переносчиков, непосредственно передающих электрон, составляют около 10— 15А. Одна из интересных особенностей состоит в том, что на отдельных этапах электронного транспорта в биоструктурах перенос электрона может с большой эффективностью происходить при низких температурах, включая температуры жидкого азота и жидкого гелия. Такие низкотемпературные стадии переноса электрона обнаружены в фотосинтетических реакционных центрах.

Туннельный механизм обеспечивает эффективный транспорт электронов между донорно-акцепторными группами, расположенными на расстоянии10—15А. Именно такой перенос может идти в дыхательной и фотосинтетической цепи, где простетические группы погружены в белковые глобулы на 5—10А и взаимодействуют друг с другом через белковую матрицу (в цитохромах). Перенос электрона происходит в белке по «электронной тропе». Рассмотрим природу этих процессов. Эксперименты показали, что перенос электрона в фотосинтетической цепи идет эффективно как при комнатных, так и при низких температурах. На рис. 11.5 приведена кривая зависимости окисления ци~ тохрома фотоактивной молекулой бактериохлорофилла в фотосинтетических реакционных центрах. Как видно, кривая носит двухфазный характер. Начальный активационный участок кривой отражает влияние температуры на перестройки ядер атомов в белковых частях переносчиков, которые необходимы для обеспечения эффективного переноса электрона. При низких температурах эти перестройки затруднены, в результате чега скорость переноса электрона падает. Однако здесь перенос происходит хотя и медленнее, но зато и мало зависит от температуры. Именно этому соответствует безактивационный низкотемпературный участок кривой переноса электрона (рис. 11.5). В основе описанного переноса электрона, сопряженного с перестройкой ядерной системы, лежат так называемые туннельные эффекты, которые связаны с электронно-конформационнымивзаимодействиями в макромолекулах. Физическая природа туннельного эффекта носит чисто квантовомеханический характер и не имеет классических аналогов. Учитывая важность элект-ронно-конформационныхвзаимодействий, составляющих основу функционирования макромолекул, мы остановимся подробнее на этих вопросах. Согласно квантовым представлениям частица (электрон, •отдельные ядра) обладает определенной вероятностью прохождения сквозь потенциальный барьер, энергия которого больше, чем энергия самой частицы (рис. 11.6). Такое «просачивание» сквозь барьер, или туннелирование, не требует тепловой активации. В квантовой механике оно связано с тем, что состояние частицы характеризуется некоторой «размазанностью». Следовательно, существует вероятность найти частицу в разных точках окружающего ее пространства, включая и область, находящуюся за потенциальным барьером. Туннельные переходы совершают электроны и ядра в комплексе ДА. В исходном состоянии (Д~А) ядерные конфигурации донорно-акцепторногокомплекса соответствуют состоянию, когда электрон локализован на доноре (Д~А). Ядерная конфигурация конечного состояния после переноса электрона и изменения электронного состояния(Д-А->-ДА~)отличается от начальной и система имеет другую энергию (рис. 11.7). Это значит, что равновесные ядерные координаты Ri и R2 начального (Д~А) и конечного (ДА~) состояний отличаются. Однако существует точка R*, в которой кривые потенциальной энергии пе_ресекаются. Очевидно, в точке R* энергии начального (Д~А) и конечного(ДА-)состояний совпадают. Допустим, чтодонорно-акцепторныйкомплекс, находившийся в состоянии Д~А, перестроился таким образом, что «го ядерная координата попала в окрестность точки R*. Само по себе это необязательно приведет к переносу электрона. Но в точках, близких к R*, сравнительно невелика ширина барьера туннелирования, отделяющего потенциальные кривые начального и конечного состояний. Поскольку около точки R* энергии начального и конечного состояний близки, то во время пребывания системы около R* электрон может успеть протуниелировать от Д~ на А. Для закрепления на акцепторе электрон должен успеть потерять часть своей энергии, чтобы не вернуться таким же образом назад. В свою очередь для этого ядерная система должна успеть перестроиться так, чтобы часть электронной энергии ушла в тепло, а вся система приобрела бы ядерную конфигурацию, соответствующую состоянию ДА~ с координатой R2. В этом случае за время пребывания электрона на А ядерная конфигурация изменится так, что система «свалится» в точку R2. В результате произойдет необратимый перенос электрона от Д к А и система перейдет в состояние ДА~.

Ядерная система комплекса ДА, находящегося в исходном состоянии Ru может попасть в окрестность точки R* за счет тепловой активации и перехода на верхние колебательные уровни исходного состояния, где координаты ядер близки к R*. Этому процессу соответствует активационныйтемпературно-за-висимый участок двухфазной кривой переноса электрона. При низких температурах ядра находятся на нижних колебательных уровнях, где ширина барьера между потенциальными кривыми начального и конечного состояний шире, чем на верхних уровнях. В этом случае существует меньшая вероятность туннелирования ядер в конечное состояние, которая уже не зависит от температуры.

Таким образом, общая вероятность W туннельного переноса электрона, сопряженного с перестройкой ядерной системы и тепловой диссипацией части электронной энергии, складывается из двух частей:

W=W0+Wle-n°>lk Б т

(11.1)

Здесь Wo — вероятность подбарьерного, не зависящего от температуры туннелирования с нижних колебательных уровней; W) — вероятность надбарьерного активационного процесса; W0<^W\,nco — энергия колебательного кванта, необходимая для активации переноса.

Электронно-конформационныевзаимодействия. Как видно, туннелирование собственно электрона неотделимо от сопряженных процессов перестройки ядерной системы. Однако последние неоднородны по своим масштабам.

Мы описали процесс начальных электронно-колебательныхвзаимодействий (рис. 11.7), которые обеспечивают туннелирование электрона и закрепление его на молекуле акцептора за счет потери части электронной энергии (<0,1 эВ). Появление электрона на акцепторе вслед за этим индуцирует более глубокие конформационные перестройки в комплексе, что, собственно, и составляет природуэлектронно-конформационныхвзаимодействий. Начальная колебательная релаксация происходит за время10~12—10~13си связана со смещениями ядер на доли ангстрема (<0,1А). Конформационные перестройки длятся, как правило, намного дольше (до10~3—106с)и могут быть сопряжены со смещениями ядер порядка нескольких ангстрем. Эти перестройки носят уже функциональный характер. В частности, в фотосинтетической системе переноса электрона они включают образование таких контактных состояний между переносчиками, которые обеспечивают направленное туннелирование между ними в транспортной цепи. Сопряжение функциональной активности переносчика электрона с его внутримолекулярной подвижностью качественно имеет следующий характер. Простетическая акцепторная группа I переносчика в отсутствие электрона совершает стохастические движения по механизму ограниченной диффузии (см. рис. 9.1) вдоль конформационной координаты R (кривая 1 на рис. 11.8). При движении она попадает в точку Ru где принимает электрон от внешнего донора. Этот акт происходит по механизму туннелирования с

закреплением электрона и потерей части энергии (^0,1 эВ) по колебательным степеням свободы внутри донорно-акцепторногокомплекса. Восстановление группы I изменяет ее зарядовое состояние и характер взаимодействия с окружением внутри белка. В результате она переходит с кривой 1 {vx{R)) на другую кривую 2 (u2(R)) конформационной энергии. Теперь, двигаясь стохастически вдоль конформационной координаты R, группа I попадает в точку R2, здесь она отдает электрон внешнему акцептору и возвращается вновь на кривую 1 (t»i (/?)). Надо ясно понимать, что само по себе стохастическое движение вдоль конформационной координаты идет с диссипацией энергии и не может быть сопряжено с ее запасанием. На своем пути молекулярная группа может взаимодействовать с окружением, например с заряженными «фиксаторами», и задерживаться на долгое время в определенных положениях. Тем самым создается напряженная конформация, в которой и происходит запасание энергии. Этот случай соответствует появлению резкого минимума на кривой конформационного потенциала, на которую перешла акцепторная группа после принятия электрона (рис. 11.9). В точке R' может находиться положительный заряд, фиксирующий положение группы Iе в напряженной конформации.