Стационарная кинетика ферментативных реакций.. уравнение михаэлиса-ментен. Влияние различных факторов.

Кинетика действия ферментов - это раздел ферментологии, изучающий зависимость скорости реакции, катализируемой ферментами, от химической природы и условий взаимодействия субстрата с ферментом, а также от факторов среды. Иначе говоря, кинетика ферментов позволяет понять природу молекулярных механизмов действия факторов, влияющих на скорость ферментативного катализа. Этот раздел образовался на стыке таких наук, как биохимия, физика и математика. Самая ранняя попытка математически описать ферментативные реакции была предпринята Дюкло в 1898 г.

На самом деле этот раздел по изучению ферментов очень важен в наше время, а именно для практической медицины. Он даёт фармакологам инструмент направленного изменения метаболизма клетки, огромное количество фармацевтических препаратов и различные яды - это ингибиторы ферментов.

Целью данной работы является рассмотрение вопроса о зависимости скорости реакции от различных факторов, каким образом можно контролировать скорость реакций и как её можно определить.

1. Кинетика Михаэлиса - Ментен

Предварительные эксперименты по изучению кинетики ферментативных реакций показали, что скорость реакции, вопреки теоретическим ожиданиям, не зависит от концентрации фермента (Е) и субстрата (S) таким образом, как в случае обычной реакции второго порядка.

Михаэлис и Ментен предположили, что скорость реакции определяется распадом комплекса ES, т.е. константой k₂. Это возможно только при условии, что k₂- наименьшая из констант скорости. В этом случае равновесие между фермент-субстратным комплексом, свободным ферментом и субстратом устанавливается быстро по сравнению со скоростью реакции (быстро устанавливающееся равновесие).

Начальную скорость реакции можно выразить следующей формулой:

v = k₂ [ES]

Поскольку константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна

K_S = [E] [S] / [ES] = k _-1/k₁

то концентрацию свободного фермента можно выразить как

[E] =K_S [ES] / [S]

Общая концентрация фермента в реакционной смеси определяется формулой

[Е]_т = [Е] + [ЕS] = K_S [ЕS] / [S] + [ЕS]

Реакция достигает максимальной скорости, когда концентрация субстрата достаточно высока, чтобы все молекулы фермента находились в виде комплекса ЕS (бесконечно большой избыток субстрата). Отношение начальной скорости к теоретически возможной максимальной скорости равно отношению [ЕS] к [Е]_т:

v / V_max= [ES] / [E]_т= [ES] / (K_S [ES] / [S] + [ES]) = 1 / (K_S+[S] +1)

Это классическое уравнение Михаэлиса и Ментен, которое со времени его публикации в 1913 г. стало фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов в течение десятилетий и с некоторыми ограничениями осталось таким до сих пор.

Позднее было показано, что оригинальное уравнение Михаэлиса - Ментен предполагало наличие нескольких ограничений. Оно справедливо, т.е. правильно описывает кинетику реакции, катализируемой данным ферментом, только при условии выполнения всех следующих ограничительных условий:

1) образуется кинетически устойчивый фермент-субстратный комплекс;

2) константа K_Sявляется константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: это справедливо, только если;

3) концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, т.е. концентрация свободного субстрата равна его начальной концентрации;

4) продукт реакции быстро отщепляется от фермента, т.е. не образуется кинетически значимого количества ЕS комплекса;

5) вторая стадия реакции необратима; точнее говоря, мы принимаем во внимание только начальную скорость, когда обратной реакцией (из-за фактического отсутствия продукта) еще можно пренебречь;

6) с каждым активным центром фермента связывается только одна молекула субстрата;

7) для всех реагирующих веществ вместо активностей можно использовать их концентрации.

Температура. С повышением температуры скорость всех ферментативных реакций увеличивается. Оптимальная температура для действия большинства животных ферментов находится в интервале 40-50 ⁰С, растительных ^__ 40-60 °С. При более высоких температурах активность снижается, и многие ферменты разрушаются уже при температуре 70-80 °С. Это явление называется тепловой инактивацией и происходит из-за тепловой денатурации белков. При низких температурах активность ферментов также снижается, но они не разрушаются.

Оптимальная температура не является постоянной величиной, она зависит от длительности температурного воздействия и влажности среды, в которой фермент действует. Ферменты очень чувствительны к нагреванию в присутствии значительного количества воды. И наоборот, при низкой влажности и в сухом состоянии ферменты выдерживают температуру близкую к 100 °С без значительной инактивации.

Влияние рН. Каждый фермент проявляет свое действие в определенных, довольно узких пределах значений рН. Различные ферменты отличаются друг от друга по оптимальным величинам рН. Для большинства гидролитических ферментов оптимум рН находится в интервале 3-6.

Присутствие активаторов и ингибиторов. Активность ферментов зависит от наличия в реакционной среде различных соединений.Вещества, которые повышают каталитическую активность ферментов, называются активаторами. В качестве активаторов могут выступать ионы металлов (натрия, калия, магния, кальция, цинка, меди, марганца, железа) и другие вещества (ионы йода, брома, хлора, SH-группы).

Существуют также соединения (ингибиторы), которые подавляют действие ферментов. Они могут быть общими и специфическими. Общие – это те, которые инактивируют действие всех ферментов. К ним относятся соли тяжелых металлов (свинца, серебра, ртути), трихлоруксусная кислота (ТХУ), танин. Специфические - действуют только на определенную группу ферментов. Для ферментов дыхания и брожения ингибиторами являются галогенсодержащие соединения (хлорацетфенол, йодацетамид и т.д.).

Различают конкурентное и неконкурентное ингибирование.

Если концентрация молекул ингибитора значительно больше концентрации субстрата, то контактная площадка фермента почти всегда занята ингибитором. В этом случае субстрату некуда разместиться, так как площадка очень мала, и ферментативная реакция не идет.

Если количество молекул субстрата и ингибитора оказывается соизмеримым, то субстрату иногда удается попасть на контактную площадку. В этом случае ферментативная реакция не прекращается, а только замедляется. Скорость ее будет зависеть от количества ингибитора.