Идентификация органических соединений методом тонкослойной хроматографии

 

8.1. Теоретические основы

 

Хроматографией называют целую группу физико-химических методов анализа и разделения веществ, которые приобрели большое значение во всех областях химии.

Различают хроматографию колоночную, тонкослойную, бумажную, газовую, ионообменную. Разделение веществ происходит в этих случаях либо в результате распределения между двумя жидкими фазами (распределительная хроматография), либо вследствие различной адсорбции вещества каким-либо адсорбентом (адсорбционная хроматография).

Под адсорбцией понимают повышение содержания соединения на поверхности некоторой твердой фазы.

Твердое вещество, на котором происходит адсорбция, называют адсорбентом; вещество, которое адсорбируется, называют адсорбатом. Различают неполярные и полярные адсорбенты.

Неполярные адсорбенты: активированный уголь, некоторые органические смолы, молекулярные сита.

Полярные адсорбенты: оксид железа (Fe₂O₃), оксид алюминия, силикагель, углеводы (крахмал, сахароза, целлюлоза).

Эффективность адсорбентов падает в приведенной последовательности.

Особое значение имеют полярные адсорбенты. Их сродство к соответствующему адсорбируемому веществу возрастает с ростом полярности последнего. Поэтому особенно прочно адсорбируется вода.

Адсорбируемость органических веществ обусловливается помимо полярности молекул также их размерами и поляризуемостью.

Органические соединения можно расположить примерно в следующем порядке по возрастанию сродства к полярным адсорбентам: галогенопроизводные углеводородов < простые эфиры < третичные амины, нитросоединения < сложные эфиры < кетоны, альдегиды < первичные амины < амиды кислот < спирты << карбоновые кислоты.

Адсорбция одного и того же органического соединения из неполярного растворителя эффективнее, чем из полярного. Напротив, уже адсорбированное соединение можно вытеснить с адсорбента только таким растворителем, у которого сродство к адсорбенту больше, чем у адсорбированного вещества. По способности вытеснять из адсорбента адсорбированные вещества (элюировать) растворители (элюенты) можно расположить в определенном порядке (элюотропный ряд) (табл. 14).

 

Таблица 14

Элюотропный ряд растворителей (по Траппу)

Петролейный эфир	Хлороформ	н -Бутиловый спирт
Циклогексан	Диэтиловый эфир	Этиловый спирт
Дисульфат углерода	Тетрагидрофуран	Метиловый спирт
Тетрахлоруглерод	Этилацетат	Вода
Дихлорэтилен	Ацетон	Уксусная кислота
Бензол	Метилэтилкетон	Пиридин

 

 

Адсорбционную хроматографию можно проводить в хроматографических колонках - вертикально закрепленных стеклянных трубках, которые заполняют тонкоизмельченным адсорбентом (неподвижная фаза) (рис. 43). В качестве адсорбентов наиболее часто используют оксид алюминия или силикагель. Колоночную хроматографию часто применяют для разделения небольших количеств веществ.

 

Рис. 43. Хроматографическая колонка

 

Раствор, подлежащий разделению или очистке (подвижная фаза), под действием силы тяжести стекает вниз, причем отдельные соединения в зависимости от их сродства к адсорбенту и растворителю адсорбируются в различной степени (или соответственно с различной скоростью проходят сквозь колонку). В идеальном случае каждое соединение занимает отдельную узкую зону.

Отдельные соединения обычно извлекают, промывая колонку растворителем (элюентом, т.е. проводят элюирование). При снятии такой «жидкой хроматограммы» более сильно адсорбируемые вещества появляются в элюате позже, чем менее сильно адсорбируемые. Анализ элюатов можно проводить методом тонкослойной хроматографии (смотри ниже). После отгонки из элюатов растворителя получают индивидуальные соединения.

Важным методом, позволяющим разделять и идентифицировать ничтожные количества веществ, в том числе и химически весьма близких друг к другу, является хроматография в тонком слое (ТСХ). В этом случае в разделении может играть роль, как распределение, так и адсорбция.

Распределение компонентов смеси происходит между водой, поглощенной носителем (адсорбентом), вода при этом образует неподвижнуюфазу, и растворителем - элюентом (подвижная фаза). При этом действует закон Нернста. Компонент смеси, легче растворимый в воде, перемещается медленнее, чем тот, который легче растворим в подвижной фазе. В качестве носителей для тонкослойной хроматографии применяют оксид алюминия, силикагель, крахмал, целлюлозу и др. В качестве элюентов могут применяться как индивидуальные растворители, так и их смеси, которые подбираются опытным путем.

Адсорбция проявляется в том, что между носителем и компонентами смеси устанавливаются адсорбционные равновесия – для каждого компонента свое, результатом чего является разная скорость перемещения компонентов смеси.

Преимуществами тонкослойной хроматографии по сравнению с другими хроматографическими методами являются высокая селективность, большая чувствительность, незначительная затрата времени на хроматографирование.

 

Для проведения тонкослойной хроматографии обычно применяют специальные пластины из стекла, алюминивой фольги или полиэфирных пленок, на которые наносят слой адсорбента. Для аналитических целей широко используют пластины «Silufol», которые представляют собой листы алюминиевой фольги, на которые посредством связующего вещества (крахмал) наносится слой силикагеля. Существуют пластины и для препаративных целей. В случае необходимости пластины могут быть изготовлены в лабораторных условиях.

 

Большое значение при проведении тонкослойной хроматографии имеет подбор элюента. При хроматографировании смесей неизвестных веществ следует ориентироваться на элюотропный ряд растворителей. Сначала используют неполярные растворители - циклогексан, затем бензол или хлороформ и в зависимости от полученных результатов переходят далее к полярным. Можно применять и смеси растворителей, например, хорошие результаты дает смесь бензола с этилацетатом (5, 10, 20% и более).

 

При подготовке к проведению тонкослойной хроматографии из продажных пластин вырезают полоски длиной ~10 см. Ширина полосок зависит от числа наносимых проб (надо предусмотреть по 1,5 см на каждую пробу) и размера сосуда, в котором будет проходить хроматографирование.

 

Нанесение веществ. Растворы испытуемых смесей наносят на пластину с помощью тонкого капилляра; при погружении в раствор такие капилляры самопроизвольно заполняются под действием капиллярных сил. Нанесенные пятна испытуемых образцов должны быть расположены на расстоянии 1—2 см друг от друга, иметь небольшой размер (2—3 мм) и находиться не ближе 1,5 см от нижнего края пластины. Если раствор образца очень разбавленный, нанесение одного пятна повторяют несколько раз, дожидаясь после каждого нанесения испарения растворителя.

 

Хроматографирование. Элюирование проводят в плотно закрытой камере (например, в стакане с притертой крышкой), атмосфера которой насыщена парами элюента. Пластину (полоску фольги) устанавливают в камере почти вертикально, погрузив конец в жидкость примерно на 5 мм.

 

После элюирования проводят проявление хроматограмм. Для окрашенных веществ специальных методов не требуется – результат виден сразу. В других случаях пластину опрыскивают с помощью пульверизатора специальными реагентами, в качестве которых обычно применяют серную кислоту, раствор перманганата калия и другие реагенты в зависимости от природы анализируемых веществ. В общем случае рекомендуется опрыскивание высушенных пластин 2%-ным аммиачно-спиртовым раствором нитрата серебра с последующим нагреванием до 105 °С (в течение 2—5 мин). Многие вещества при этом дают черные пятна на темном фоне.

Универсальным проявителем для многих веществ является йод, пластину при этом помещают на некоторое время в сосуд с несколькими кристаллами йода. Проявляющее действие йода связано с адсорбцией его паров, а также его известной реакцией с крахмалом (посинение), содержащимся в составе пластин.

 

Если анализируемое вещество поглощает в УФ-области спектра, (например, соединения, содержащие бензольные кольца поглощают в области 254 нм) для проявления пластину облучают УФ-светом соответствующей длины волны. В этом случае для проведения анализа используют пластины, содержащие в слое адсорбента специальные вещества (люминофоры), светящиеся при облучении. При освещении такой хроматограммы УФ-светом на том месте, где адсорбировано соединение, будет заметно красно-фиолетовое пятно (результат поглощения), тогда как пластина в целом имеет зеленоватый оттенок вследствие свечения люминофора.

 

Количественной мерой скорости переноса вещества при использовании определенного адсорбента и растворителя является величина R_f (от англ. retention factor = «коэффициент задержки»). Величину R_f определяют как частное от деления расстояния от пятна до стартовой линии на величину пробега растворителя от стартовой линии. Эта величина всегда меньше 1 и не зависит от длины хроматограммы. На величину R_f оказывают влияние различные факторы: температура, природа адсорбента и элюента, концентрация вещества, присутствие примесей в элюенте.

На рисунках 44а,б приведен примерный вид хроматограмм до и после элюирования.

 

Рис.44.Вид хроматограмм (а – до элюирования, б – после элюирования)

8.2. Методика выполнения работы

Необходимые материалы:

 

1. Бумага для тонкослойной хроматографии «Silufol»

2. Стакан с покрывным стеклом

3. Пенициллиновые флаконы для растворения образцов

4. Капилляры для нанесения веществ

5. Мерные цилиндры и пипетки

6. Растворители для приготовления элюентов и растворения образцов

7. Пинцет

8. Простой карандаш (мягкий)

9. Измерительная линейка

10. Емкость с иодом для проявления

 

Каждый студент выполняет два задания. В первом предлагается провести анализ смеси красителей (элюент задан) путем сравнения смеси с индивидуальными веществами, определить R_f для каждого компонента. Анализ хроматограмм проводится визуально без специального проявления.

Во втором задании проводится анализ указанных преподавателем веществ с подбором элюента и определением R_f и установлением соединения путем сравнения с известными индивидуальными веществами. Для проявления хроматограмм используется иод.

 

Порядок выполнения работы

 

1. Получить задание у преподавателя

2. Поместить в пенициллиновый флакон небольшое количество анализируемого вещества и прибавить растворитель. Если он не задан, провести подбор растворителя. Желательно, чтобы вещество полностью растворилось, и концентрация его при этом не была слишком высокой.

3. Нанести на полоску бумаги «Silufol» осторожно карандашом стартовую и финишную линии.

4. Нанести с помощью капилляра на стартовую линию растворы анализируемых веществ таким образом, чтобы диаметры пятен не были слишком большими. При этом следует избегать касания поверхности адсорбирующего слоя руками и его механического повреждения.

5. Перед хроматографированием необходимо дождаться испарения растворителя с поверхности бумаги.

6. Подобрать элюент, если он не задан преподавателем, используя либо индивидуальные растворители, либо их смеси из предложенного набора. При этом желательно избегать как слишком малых, так и слишком больших значений R_f, так как при небольшом смещении вещества с линии старта можно не заметить его разделения на возможные компоненты, а при большом значении R_f есть опасность ухода возможных компонентов за линию финиша.

7. Налить в стакан для хроматографирования такое количество элюента, чтобы его уровень находился ниже стартовой линии и не мог затронуть нанесенные вещества, накрыть стакан стеклом и выдержать некоторое время для заполнения стакана парами элюента

8. Поместить в стакан бумагу с нанесенными веществами и накрыть его стеклом.

9. Как только фронт элюента достигнет финишной линии, хроматограмму извлечь пинцетом.

10. После испарения элюента с поверхности бумаги проявить хроматограмму (в случае необходимости) в парах иода, проявленную хроматограмму следует опустить в сосуд с дистиллированной водой для лучшего закрепления.

11. Определить значение R_f. Для этого с помощью линейки измеряют расстояние от линии старта до финишной линии и от линии старта до центра пятна каждого из анализируемых веществ. Значение R_f рассчитывают по известной формуле:

 

где l_п – расстояние от стартовой линии до центра пятна;

l_э – расстояние, пройденное элюентом.

 

12. Нарисовать полученную хроматограмму в лабораторном журнале

13. Сделать вывод

 

 

8.3. Контрольные вопросы по теме «Тонкослойная хроматография»

 

1. Что такое хроматография?

2. Перечислимте основные виды хроматографических методов анализа и разделения веществ.

3. Какую хроматографию называют распределительной?

4. Что такое адсорбция?

5. Что такое адсорбционная хроматография?

6. Перечислите основные виды адсорбентов, отметьте среди них полярные и неполярные.

7. Что такое элюотропный ряд растворителей?

8. Что такое колоночная хроматография? В каких целях ее используют?

9. В каких случаях применяют хроматографию в током слое (ТСХ)?

10. К какому виду хроматографии (адсорбционная, распределительная) можно отнести тонкослойную хроматографию?

11. Что при тонкослойной хроматогрфии является неподвижной фазой?

12. Что такое элюент?

13. Какие вещества можно использовать в качестве носителей при тонкослойной хроматографии?

14. Как подбирают элюент при проведении тонкослойной хроматографии?

15. Назовите преимущества тонкослойной хроматографии по сравнению с другими хроматографическими методами?

16. Опишите устройство пластин «Silofol».

17. Каким образом вещества наносят на пластины при проведении ТСХ?

18. Ким образом проводят хроматографирование при проведении ТСХ?

19. Перечислите варианты проявления хроматограмм при проведении ТСХ.

20. Что такое коэффициент задержки, что он характеризует, и как его определяют?