Добыча и ограничения геномной ДНК

Выделение ДНК

Начальный культур 8/0, 8/20 и 8/21 были GM17 на ночь в 3х 5 мл-Medium

одет (2.2.1). Позже прямое сравнение результатов методом ПЦР-доказательство

позволить, был взят за начало культуры по 1 мл бактериальной взвеси и

Page 51

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ПЦР согласно протоколу капитальному ремонту (2.7.1). Геномная ДНК была

Genomic-Tip 500/G-Kit (Qiagen) согласно прилагаемым протоколом извлечены и в 100 мкл 10

мм Tris-HCl pH 8,0 добавил. Средний размер фрагментов составляет по

Производителя 20-160 КБ. Характеристика полученной фактической длины

Фрагменты ДНК осуществлялась с помощью с помощью электрофореза геля Агарозы ДНК количественное

Фотометры, где 1 OD260 50 мкг/мл, двойной, котор сели на мель ДНК соответствует.

Ограничения с Sau3A

После добавления 3 мкл Sau3A (10 ед/мкл, MBI Fermentas) и 3 мкл буфера R 10 мкг были

геномной ДНК в 30 мкл рестрикционных подход при 37°C 2 ч выдерживают. Реакция

было! через 5 минут Нагревание до 95°C. После этого отрезка ДНК был

с помощью PCR-Purification Kit (Qiagen) и чистить с 30 мкл 10 мм Трис-HCl pH от 8,5

колонны eluting. Определение средней длине Фрагмента и

Количественное определение ДНК проводилась в свою очередь с помощью Agarosegel и фотометры.

ДНК-методы Маркировки

Монтаж Cy5-маркированных dCTPs во время ПЦР-реакции

ПЦР с парами Праймеров Авива и P936_X1out был аналог 2.7.2 и 2.7.3

выполнено (50 мм KCl, 10 мм Трис-HCl pH 9,0, 3 мм MgCl2в зависимости от 0,2 мм dATP, dGTP,

dCTP и dTTP, чем 0,4 мкм праймеров, 1 единица Taq-полимеразы, 4 мкл ДНК в 50 мкл подход). Чтобы

получить хорошую отметку в ПЦР была выявлена ДНК-фрагментов,

Соотношение маркированных немаркированных для fluoro ссылка Cy5-dCTP (Amersham

Pharmacia Bioscience) в соотношении 1:40, 1:20 и 1:4 колеблется.

Коэффициент немаркированных /

Выделенный Cy5-dCTPs

Конц. непомеченных

DCTPs

Конц. выделенных

DCTPs

Конц. dCTPs в

Подход

1:40

0,195 мм

0,005 мм

0,2 мм

1:20

0,19 мм

0,01 мм

0,2 мм

1:4

0,15 мм

0,05 мм

0,2 мм

Random Primed Labelling ДНК с Cy5-dCTP

Маркировка 2 мкг отрезанный геномной ДНК проводили с использованием ДНК BioPrime

Labelling System (Life Technologies) в модификации протокола Stanford University

Page 52

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

(http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/4_genomic.htm). К ДНК в 20 мкл 2,5 х были

Random Primer решение и H2O до общего объема 40 мкл добавляли. В

Реакция подход инкубируют 5 мин при 95°C и затем при охлаждении на льду

система смягчения грунтовки позволяет. После добавления 5 мкл dNTP-Mix (1 мм dCTP, 2

мм dATP, 2 мм dGTP, 2 мм dTTP в 10 мм Трис-HCl рН 7,5, 1 мм ЭДТА), 3 мкл 1 мм

Fluoro ссылка Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia Bioscience) и 2 мкл Klenow фрагмент

(40 ед/мкл) смешивали подход и 3 ч при 37°с. инкубируют. Через 5 мкл 0,5 М ЭДТА рН

8,0 реакция была остановлена.

Nick Translation System

Установка Cy5-dCTP с небольшими изменениями производилась через ник Translation

System (Promega) в соответствии с протоколом для установки радиоактивно-выделенных нуклеотидов. 1 мкг

отрезанные геномной ДНК был с 5 мкл 10х Nick Translation Буфера (500 мм Трис-

HCl, рН 7,2, 100 мм MgSO4, 1 мм DTT), чем 3,3 мкл dATP, dGTP и dTTP (концентрация

чем 300 мкм), 1 мкл 1 мм fluoro ссылка Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia Bioscience), 5 мкл

Nick Translation Enzyme Mix (1.000 ед/мл ДНК полимераза I, 3 ед/мл DNase I, 50%

Глицерин, 50 мм Трис-HCl рН 7,2, 10 мм MgSO4, 0,1 мм DTT, 0,5 мг/мл BSA) смешанные

и до реакционном объеме 50 мкл с Ч2O пополняется. Для

Метки реакцию инкубируют подход 2 ч при 15°C. Реакция была тогда

при добавлении 5 мкл 0,25 М ЭДТА рН 8,0 остановился.

Очистка выделенной ДНК

Отделение dNTPs и выделения ферментов осуществлялось с Microcon YM 30

Фильтры (Millipore) как в корпоративном журнале описано. Отрезанная и начинает использовать

геномная ДНК была включена в конечный объем 12 мкл TE pH 7,4 и

с помощью фотометра сканирования самонадеянно. Расчет эффективности проводилась Маркировка

по следующей формуле:

c Нуклеотиды

E 260 нм • ε Cy5 • d

Эффективности маркировки =  = 

c Cy5

E 649 нм • ε Нуклеотиды • d

с ε Cy5 =250.000 M-1см-1 и ε Нуклеотиды = 12.025 М-1см-1.

До гибридизации на ДНК-Массив ДНК хранили при -20°C.

Page 53

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Пред-)гибридизация микро массивы

Состав гибридизации различных решений в таб. 18 показано. Это

Рецепт для приготовления раствора 1 был любезно миссис дипл. Biol. (t. o.) Denja Drutschmann

обеспечено. Растворы 2 и 3 основаны на микро массива

Гибридизация журнала Стэнфордского университета или из in situ гибридизации

(см. 2.6.3) известной процедуре. При этом каждые 2 разные были Stringenzen

отлажена. Которые Prähybridisierung ДНК-микро-массивах произошло в 50 мл каждого

Гибридизация решение без учета Целевой ДНК за 1 ч при 46°C.

Hybridisie-

Rungslsg. 1

Hybridisierungslsg. 2

Hybridisierungslsg. 3

Формамид

20%

20%

0%

20%

0%

SSC

-

4x

4x

-

-

EDTA pH 7,0

1 мм

-

-

-

-

NaCl

600 мм

-

-

900 мм

900 мм

Трис рН 8,0

10mM

-

-

20 мм

20 мм

SDS

-

0,02%

0,02%

0,01%

0,01%

Denhardt's Реагент

1x

1x

1x

-

-

Fish-ДНК

500 мкг/мл

500 мкг/мл

500 мкг/мл

-

-

Tab. 18. Гибридизация решения для ДНК-чип-гибридизации.

Для гибридизации необходимые покровные стекла были очищены с моющим средством и

тщательно смывают водой. После Prähybridisierung была жидкость от

ДНК-Массив не капала, это но сушат. Для подготовки

Гибридизация реакции были 170 мкл гибридизации раствора с 30 мкл выделенных ДНК

смешать и на 10 мин денатурации в ПЦР-Cycler (Ландграф) при 95°C нагревается. Как

Положительный контроль был 1 мкл одного Cy3 меченных, к EUB338-зонд отворотом

комплементарных олиго-нуклеотида признал. Сразу после денатурации ДНК-

Массив гибридизации с решением überschichtet, пузырьков воздуха с подготовленными

Палубы покрыты стеклами и на ночь при 46°C во влажной камере equilibrierten

инкубируют.

После гибридизации ДНК-микро массив был погружен до тех пор, пока в промывной раствор 1

себя покровное стекло было заменено. Затем была утка по-разному string, 20-

минутный стиральные действия, не удаляет твердый ДНК с поверхности (моющего раствора 1:

2x SSC, 0,2% SDS; моющий раствор 2: 1x SSC, 0,1% SDS; промывочный раствор 3: 0,5 x SSC, 0,05%

Page 54

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

SDS). Поскольку SDS-остатки могут увеличить Фон, был с микро массива в последнюю очередь

SDS-свободный моющего раствора 3 промыть и либо в N2Питания или через 5 минут

Центрифугирование в Greiner-пробирки (Eppendorf центрифуга с Swing-Out-ротор 500-1.000

мин) сушат. Сигналов детектирование осуществлялось по флуоресценции-сканер (аксон, компания Biozym)

используя GenePix 3.0 программного обеспечения.

Page 55

3. Результаты

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Результаты

3.1. Демографического анализа с флуоресцентной in situ гибридизации