Фиксация клеток из образцов Творога

Для отделения клеток от белковых и липидных доля творога 30 мл образцы были

Ферментацию культуры разливается в 50 мл Greiner-в пробирку и центрифуги охлаждения

(Тип Eppendorf 5403) 5 мин при 5000 х g центрифугируют. Супернатант отбрасывали,

Осадок в 1 мл промывочного буфера 1 (100 мм Na2HPO4, 150 мм NaCl, 10 мм ЭДТА, 40 мм

NaOH) находиться в 1,5 мл реакционном сосуде (Biozym) и еще раз обличает в

8.000 x g в течение 2 мин центрифугируют. Супернатант отбрасывали повторно, осадок, в свою очередь

в 1 мл промывочного буфера 1 и находиться при 8000 х g 2 мин abzentrifugiert.

Этанол-Фиксация

Для этанола-фиксация клеточный осадок был в 250 мкл 1xPBS (130 мм NaCl, 10 мм

Na2HPO4/Близко2PO4, pH 7,4) записан на Vortex (ReaxTop, Heidolph)

находиться и с 250 мкл холодной unvergällten 96% EtOH зафиксировано. Клетки могут

несколько месяцев при -20°C храниться.

Para формальдегида фиксации (PFA фиксации)

Которые abzentrifugierten клетки были включены в 200 мкл 1xPBS и очень хорошо

находиться. После добавления 600 мкл eisgekühlter PFA-фиксация раствора (2 г

Para формальдегид, 16,6 мл 3 раза PBS, 30 мл, H2O, pH 7,2 - 7,4) вы были за 3 до 16 ч при 4°C

инкубируют. Фиксированные клетки были abzentrifugiert, Супернатант отбрасывается, клетки

с 1 мл 1xPBS промывают и снова abzentrifugiert. Которые гранулированных клеток были в 250

мкл 1xPBS записан и находиться с 250 мкл холодной unvergällten 96% EtOH

пошатнулся.

Ферментную выщелачивание при грам-положительных бактерий

Подвески с фиксированных клеток была снижена на 6 полей в ВМТ, и при

46°C в режиме теплового шкафа (Heraeus) сушат. Через OT погрузиться в восходящих

EtOH-серия (50, 80, 96% Этанола; каждая 3 мин), клетки были на OT

дегидратированные и nachfixiert. После короткой Сушки в поле были на каждый OT-20 мкл

Лизоцим раствора (1 мг/мл лизоцим из куриного белка, 100.000 ед/мг в ТЭ; Sigma)

aufpipettiert. Затем OT инкубируют 20 мин на льду. После

Ферментные он был лечение с Ч2O промыть, опять EtOH-полечиться

и сушат.

Page 45

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Одноместный клеточной гибридизации

В OT-поле 9 мкл гибридизации раствора (0,9 М NaCl, 20 мм Tris-HCl, 0,01% SDS,

Х% формамид) и 1 мкл выделенного зонд (концентрация 50 нг/мкл) aufpipettiert и 1,5 ч при

46°C в изотонический äquilibrierten влажной камере, состоящей из 50 мл Greiner-

Трубы с помощью гибридизации с решением увлажненной целлюлозы шт состав,

гибридизации. Чтобы stringentes зонда Связать обеспечения, который был

Формамид концентрации в гибридизации раствора в соответствии с табл. 4 перечисленные

Литературные данные для каждого зонда меняется и специфичность за счет собственных экспериментов с

Ссылка племен проверено. После гибридизации зонда был смыванием с 2

мл моющего раствора 2 (20 мм Трис, 0,01% SDS, 5 мм ЭДТА, X M NaCl) и OT

20 мин при 48°C в 50 мл нагретого моющего раствора инкубируют 2. При этом необходимое было

Строгость варьируя NaCl концентрации по формуле прекращено.

0,5 (% FХ.) = -16,6 log [M Na+]

при этом F являетсяХ.

содержащий формамид концентрации в гибридизации решение

[M Na+] молярная NaCl-концентрация

При NaCl концентрации меньше 0,3 М 5mM были ЭДТА для промывочного буфера

правда, иначе уже следы двух валентных катионов строгость моющего буфера

благодаря сильной гибридной стабилизации могут влиять на. В заключение с OT H были2O

промыты и высушены.

Одновременный двойной гибридизации с разными маркированных зондов

Возможностей флуоресцентной in situ гибридизации эксплуатировать, пока были

один гибридизации по 1 мкл с двух различных флуоресцентных красителей выделенный

Зонды различной специфичности с использован, например, FLUOS-отмеченные EUB338-зонд

в ТАМРЕ-выделенный Lactococcus -зонд LLA271.

Общее определение количества клеток с DAPI

Для определения общего количества клеток OT образец после гибридизации был

с DAPI раствора (1 мкг/мл 4,6-Diamidino-2-phenylindol-дигидрохлорида в Ч2O)

überschichtet 5 мин и инкубируют в темноте. OT был с Ч2O промыть и при RT

сушат. Чтобы замедлить Обесцвечивания флуоресцентных красителей, которые были OT

в Citifluor-Vectashield смеси встроенные и покрывается покровным стеклом. Для этого

Page 46

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

решения Citifluor (Citifluor Ltd. London, UK) и Vectashield (Vecor были

Laboratories Inc., Burlingame, США) смешивали в соотношении 4:1.