А. Реализация и передача генетической информации — КиберПедия 

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...

А. Реализация и передача генетической информации

2017-06-13 670
А. Реализация и передача генетической информации 0.00 из 5.00 0 оценок
Заказать работу

Хранение информации. Генетическая информация закодирована в последовательности нуклеотидов ДНК (DNA), организованных в функциональные участки, называемые генами. [РНК (RNA) как носитель генетической информации используется только некоторыми вирусами.] Участки ДНК кодируют белки, т. е. они содержат информацию об аминокислотной последовательности белков. Каждый остаток представлен в ДНК своим кодовым словом (кодоном), состоящим из трех следующих друг за другом оснований. Так, ДНК-кодон для фенилаланина представлен тринуклеотидом ТТС (2) На уровне ДНК кодоны образуют ее некодирующую цепь [последовательность нуклеотидов которой соответствует последовательности мРНК (mRNA)] (см. с. 90).

Репликация. Во время деления клеток генетическая информация должна перейти в дочерние клетки. Для достижения этого вся ДНК клетки копируется в процессе репликации во время S-фазы клеточного цикла (см. с. 380), при этом каждая ее цепь служит матрицей для синтеза комплементарной последовательности (1, см. с. 238).

Транскрипция. Для экспрессии гена, т.е. синтеза закодированных в нем белков, последовательность нуклеотидов кодирующей цепи ДНК должна быть трансформирована в аминокислотную последовательность. Поскольку ДНК не принимает непосредственного участия в синтезе белка, информация, хранящаяся в ядре, должна быть перенесена на рибосомы, где собственно и осуществляется биосинтез белков. Для этого соответствующий участок кодирующей цепи ДНК считывается (транскрибируется) с образованием гетерогенной ядерной РНК [гяРНК (hnRNA)], т. е. последовательность этой РНК комплементарна кодирующей цепи ДНК (3; см. с. 90). Поскольку в РНК вместо тимина содержится урацил (см с. 86), AAG триплет ДНК трансформируется в UUC-кодон гяРНК.

Созревание РНК. У эукариот гяРНК, прежде, чем покинуть ядро в виде матричной РНК (мРНК, 4), претерпевает существенные изменения: из молекулы вырезаются избыточные (некодирующие) участки (интроны), а оба конца транскриптов модифицируются путем присоединения дополнительных нуклеотидов (см. с. 242).

Трансляция. Зрелая мРНК попадает в цитоплазму и связывается с рибосомами, преобразующими полученную информацию в аминокислотную последовательность. Рибосомы (см. с. 246) — это рибонуклеопротеидные комплексы, включающие несколько десятков белков и несколько молекул рибосомной РНК (рРНК (rRNA), см. с.88). Рибосомные РНК выполняют функцию структурного элемента рибосом, а также принимают участие в связывании мРНК и образовании пептидных связей.

Механизм преобразования генетической информации основан на взаимодействии кодонов мРНК с транспортной РНК [тРНК (tRNA), см. с. 88], которая переносит на рибосому аминокислоты, связанные с 3'-концом тРНК, в соответствии с информацией, закодированной в мРНК. Примерно в середине цепи тРНК расположен триплет (например, GAA), называемый антикодоном и комплементарный соответствующему кодону а мРНК. Если транслируется кодон UUC, то с ним взаимодействует антикодон в составе Phe-тРНК (5), несущей на 3'-конце остаток фенилаланина. Таким образом, остаток аминокислоты занимает положение, в котором на него может быть перенесена растущая полипептидная цепь, связанная с соседней тРНК (6).

Активация аминокислот. Прежде чем связаться с рибосомой, транспортные РНК присоединяют соответствующую аминокислоту с помощью специфического «узнающего» фермента (7, схема на с. 244), обеспечивающего точный перенос (трансляцию) генетической информации с уровня нуклеиновых кислот на уровень белка.

 

Можно отметить три варианта переноса генетической информации, обнаруженные в различных организмах.

.1. Перенос генетической информации в пределах одного класса нуклеи­новых кислот, т. е. от ДНК к ДНК или у некоторых вирусов от РНК к РНК. называется репликацией или самоудшеннеи. Иногда такой вид переноса наследственной информации образно называют.«переносом из хранилища в хранилище», подразумевая под этим, что ДНК (или РНК у некоторых виру­сов) выполняет функцию хранилища генетической информации. Репликация происходит во время деления клеток (в 5:фазу митотического цикла) и раз­множения вирусов, когда необходимо целиком передать информацию от одно­го организма к другому. Возможна репликация отдельных участков ДНК, называемая амплификацией.

2. Перенос информации между разными классами нуклеиновых кислот: ДНК—РНК, называется транскрипцией или переписыванием. В отличие от репликации при транскрипции происходит копирование не целиком всей инф ормации, заложенной в молекуле ДНК. а только ее отдельных участков, ходе транскрипции образуются все типы РНК: главные (мРНК, тРНК, рРНК) и минорные.

Из' этого следует, что циСтроны ДНк содержат информацию не только о структуре полнпептндной цепи, но и о структуре тРНК, рРНК и минорных типов РНК.

. Транскрипция бывает прямая (от ДНК к РНК) и обратная (от РНК к ДНК)- Впервые обратная транскрипция была выявлена у РНКовых опухолеродных вирусов (называемых онкорнавнрусами), которые встраиваются в ДНК клетки-хозяина путем обратной транскрипции. Чужеродный' участок ДНК — копия вирусной РНк— вызывает опухолевую' трансформацию клетки, Возможно, обратная транскрипция имеет значение не только при опухолевой трансформации клеток, но и при их нормальной жизнедеятельности -или в ходе их дифференцировки. В- принципе обратная транскрипция возможна при использовании любого типа РНК, а не только мРНК.

3. Перенос генетической информации от мРНК к белку, т. е. в пределах разных классов макромолекул, называется трансляцией или переводом. При трансляции происходит как бы перевод информации с «языка» нуклеино­вых кислот,, имеющего нуклео'тидныЙ алфавит, на «язык» полипептидной цепи, в котором использован аминокислотный алфавит. Транслируется только мРНК. Остальные типы РНК являются готовыми продуктами генов, образую­щимися прн транскрипции. рРНК и тРНК играют вспомогательную роль при трансляции. Трансляция, по термодинамическим и биологическим соображе­ниям, может быть только прямой — от мРНК к белку. Обратная трансляция запрещена.

Подобное направление переноса генетической информации от ДНК через РНК к белку называется цвмтралопоил гшстулшим молекулярной генетики, который был сформулирован Криком. Согласно ему не может быть переноса информа­ции от белка к РНК,' но допускается перенос от РНК к ДНК. Если вдруг обна­ружится перенос информации от белка к РНК, то придется пересмотреть весь фундамент молекулярной генетики.

Итак, первичными продуктами действия генов являются два типа макро­молекул. Это прежде всего белок и некоторые тнпы РНК: рРНК, тРНК и ми­норные РНК-

Все виды передачи генетической информации основаны на матричном механизме. Это означает, что для каждого ил них необходима матрица. При репликации матрицей служит одна из цепей ДНК (или РНК у вирусов), при транскрипции — участок ДНК (прямая транскрипция) или РНК (обратная транскрипция), а при трансляции — мРНК, т. е. матрицей может быть только нуклеиновая кислота. Матрица позволяет с большой точностью (что очень важно, поскольку речь идет о наследственных свойствах) и экономичностью (что не менее важно) воспроизводить имеющуюся в клетке генетическую ин­ формацию. Точность копирования соответствующей нуклеиновой матрицы обеспечивает правило комплементарности азотистых оснований нуклеотидов, согласно которому происходит спаривание А с Т (или с У в РНК) -и Г с Ц. Благодаря этому порядок чередования нуклеотидов в каждой новой полинуклеотидной цепи комплементарен матрице.

 

Билет 58

 

Теоретически возможны несколько вариантов репликации ДНК: консерватив­ная, когда дочерняя двойная спираль ДНК образуемся без разделения цепей родительской ДНК; полуконсервативная) при которой цепи родительской ДНК расходятся, и на каждой из родительских цепей образуются комплементарные цепи дочерней ДНК, и дисперсивная, которая предусматривает расщепление в нескольких местах цепей родительской ДНК и образование на ней новых цепей ДНК-

В 1957 г. Меселсон и Сталь установили, что в живых организмах репли­кация ДНК происходит по полуконсервативному механизму. Сначала он пред­ставлялся просто:на расплетающихся цепях ДНК, которые являются матри­цами, образуются комплементарные новые цепи ДНК. Нуклеотиды при этом выстраиваются по матрице соответственно правилу комплементарности, а «сшиваются» друг с другом фосфодиэфирнымй связями с помощью специаль­ного фермента ДНК-полимеразы. Впоследствии оказалось, что ДНК-полимераза не способна начать синтез новой ДНК из свободных нуклеотидов; она лишь способна удлинять полинуклеотидную цепь, т. е. для нее нужна затравка. В настоящее время репликация ДНК представляется сложным, многоступенчатым процессом,

Для репликации ДНК необходим ряд условий;

1) наличие дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дГТФ i! дЦТФ) как структурного материала для сборки новых цепей ДНК;

2) расплетение двойной спирали ДНК;

3) образование затравки;

4) наличие ферментов, участвующих в образовании затравки и синтезе новых полинуклеотидных цепей ДНК.

Механизм репликации ДНК у прокариотов. Каждая стадия процесса репликации протекает с участием соответствующих ферментов.

/. Расплетающие белки разрывают водородные связи между комплемен­тарными основаниями двойной спирали ДНК- В результате двойная спираль расплетается и расходится на отдельные цепи. (Внешне это напоминает рас­стегивание застежки «молния».) Расплетенный участок ДНК называется репликативной вилкой. В его образовании участвует сразу до 200 молекул расплетающего белка, поэтому каждая ветвь репликативной вилки, *на кото­рой происходит начало синтеза новой ДНК, имеет протяженность до 2000 неспаренных оснований. Механизм действия расплетающих белков детально не изучен. Возможно, для расплетения ДНК используется энергия АТФ.

2. «Затравочная» ДНК-зависимая РНК-полимераз'а'— особый вариант РНК-полимеразы (обычно эти ферменты участвуют в транскрипции), которая образует небольшую РНК-затравку («шраймер»), комплементарную участку ДНК в репликативной внлке. Синтез РНК-затравки идет от конца 5' к концу 3'. Порядок чередования нуклеотидов в РНК задается ДНК-матрицей, а сшивка их 5'->-3'-фосфодиэфирнымй связями осуществляется РНК-полиме-рвзой.

3. ДНК-Полимеразы. Известны три формы ДНК-полимераз у прокарио­тов: I, II и III. Все они обладают двумя видами активности: полимеразной и нуклеазной. Полимеразная состоит в образовании фосфодиэфирных свя­зей 5'-»-3' между дезоксирибонуклеотидами, нуклеазная — в гидролизе фос­фодиэфирных связей.

ДНК-полимераза I расщепляет РНК-затравку при репликации (действует как РНКаза) и на ее месте синтезирует комплементарный фрагмент ДНК. ДНК-полимераза - II имеет очень низкую полимеразную активность. Функция ее в репликации неизвестна.

: ДНК-Полимераза III является основным ферментом репликации, синтезируя на разошедшихся цепях ДНК комплементарные участки новой ДНК в направлении 5'-*-3'.

4. Рибонуклеаза Н. Участвует в гидролизе РНК-затравки в ходе репли­кации наряду с ДНК-полимеразой I.

5. ДНК-Лигазы (соединяющие ферменты). Обнаружено несколько фер­ментов, функция которых состоит в соединении друг с другом новосинте-зироэанных 'фрагментов ДНК- ДИК-Лигазы образуют фосфодиэфирные связи 3'-*-5', используя НАД* в качестве источника аденнлила.

Общая схема репликации представляется следующим образом (рис, 65). Под действием расплетающих белков образуются сразу в нескольких местах молекулы ДНК (как правило, на внутренних участках) репликативные вилки. Начинается репликация (инициация) с образования РНК-затравки с помощью РНК-полнмеразы в направлении 5'-*-3'. После завершения синтеза короткой цепи РНК на матрице ДНК фермент отделяется от ДНК, Далее происходит присоединение к РНК-затравке дезоксирибонуклеотидов с по­мощью ДНК-полимеразы III в направлении 5'-*3', Образуется гибридная цепь: РНК— ДНК, Причем ДНК-полимераза III синтезирует короткие фраг­менты ДНК (фрагменты Оказаки) на другой родительской цепи репликатив-ной вилки. Интересно, что по ходу синтеза ДНК-полимераза III может исправлять ошибки при неправильном спаривании нуклеотидов. Если произо­шла ошибка, то этот нуклеотид тут же отщепляется ферментом благодаря нуклеазной активности, а прн правильном спаривании" нового нуклеотида присоединяет его к уже имеющемуся фрагменту ДНК.

РНК-Затравка после действия ДНК-полимеразы III полностью удаляет­ся или специфической рибонуклеазой Н, или ДНК-полимеразой I. На месте бывшей РНК-затравки наращивается цепь ДНК с помощью ДНК-полиме­разы I. Соединение синтезированных фрагментов ДНК (фрагментов Оказаки) в направлении 3'-*5' происходит с помощью ДНК-лигазы,

Биологический смысл репликации – сохранение и точная (неискажённая) передача генетической информации в ряду поколений клеток и организмов, а также при воспроизведении ДНК-содержащих структур (митохондрий, пластид, некоторых вирусов).

 

 

Билет 59

 

 

В процессе жизнедеятельности зрелой клетки только часть генетической ин­формации, записанной в ДНК хроматина, реализуется при транскрипции в виде копий РНК- Участки неактивной, или репрессированной, ДНК входят в состав глобулярных нуклеосом хроматина, а активной — в состав межнуклеосомных фрагментов или «развернутых» линейных нуклеосом.

Элементарную единицу транскрипции у прокариотов и зукариотов, т. е. отрезок ДНК, подвергающийся транскрипции, принято называть транскрип­тоном. Иногда транскрнптоны прокариотов называют также оперонами

Отдельные участки транскриптонов несут разную функцию, Одна группа участков относится к информативным, а другая — к неинформативным. К ин­формативным относятся структурные цнстроны или гены, несущие информа­цию о структуре полипептндной цепи или нематричных РНК (рРНК, тРНК, других низкомолекулярных стабильных РНК); неинформативные выполняют другие функции и не содержат генетической информации.. Совершенно неожиданно оказалось, что структурные гены в транскриптоне могут быть двух типов; непрерывными и «разорванными», или прерывистыми, Непре рывность генов считалась абсолютным признаком.. Тем не менее во многих структурных генах, особенно зукариотов, генетическая информация записана С перерывами. Участки в структурных генах, несущие информацию, называются экзанами.

а неинформативные — интронами Возможно, нитроны играют дополнительную регуляторную функцию для экзонов.

В ДНК хромосом обнаружены подвижные фрагменты, которые названы мобильными генами или транспозонами. Миграцию транспозонов объясняют механизмом обратной транс­крипции, т. е. сначала образуется транскрипт мобильного гена, а затем он используется как матрица для встраивания ДНК-копин а другом участке хромосом. Функция «прыгающих» генов еще не ясна Известно, однако, что они могут вызывать перестройки в геноме, изменять функцию тех участ­ков ДНК. рядом с которыми они встраиваются. Вместо с тем мобильные гены, участвуя в перестройке отдельных фрагментов хромосом, влияют на изменчи­вость организмов и их эволюцию.

Начальный участок транскриптона, с которого начинается транскрипция, называется промотор. К нему присоеди­няются белки, облегчающие начало транскрипции, и фермент транскрипции РНК-полнмераза. Оператор — участок ДНК, связывающий белки-регуляторы транскрипции. Таким бел ком-регулятором транскрипции у прокариотов явля­ется репрессор.

У эукариотов после промотора находится участок транскрнптона, кото­рый называют акцепторной или управляющей зоной. С ней взаимодействуют различные регуляторы, влияющие на транскрипцию. В акцепторной зонеимеется фрагмент ДНК (его называют усилитель или «эихансер»), который облегчает транскрипцию с участием РНК-полимеразы.

К оператору, или акцепторной зоне, примыхают структурные цистроны, или гены, содержащие перемежающиеся участки интронов и экзонов. В одном транскриптоне может быть один структурный цистрон (моноцистронный транскриптон) или несколько (полицистронный транскриптон). В конце транскриптона имеется последовательность нуклеотидов, которая является своего рода сигналом об окончании транскрипции, — терминатор. РНК, образующаяся при транскрипции, называется транскриптом. Транскрипт — комплементарная копия транскриптона от промотора до терминатора.

Для транскрипции необходимы определенные условия:

1) участок ДНК. подлежащий TpdKCKpнянин, долж'Л-; быть расгиетуя для образования одноцепочсчной матрицы (только одну щ?пь ДНК служит матрицей при синтезе РНК; ten и бы обе цепи ДНК одновременно использо­ вались в качестве матрицы, то на одном траискрпитоне синтезировались бы две комплементарные РНК, несущие информацию для двух разных белков);

2) наличие рнбонуклеонидтрифосфатив (АТФ, ГТФ. УТФ ЦТФ) для син­теза РНК;

3) наличие специальных ферментов транскрипции ДНК-завнсимыч РНК -полймераз, синтезирующих РНК по матрице ДНК.

Механизм.транскрипции ДНК Транскрипция имеет три фазы: инициацию, элонгацию и терминацию, т. е. начало, продолжение и окончание син­теза РНК (рис. 67).

Инициация транскрипции происходит вследствие присоедине­ния ДНК-зависимой РНК-полимеразы к промотору, обладающему высоким сродством к этому ферменту. Промотор — стартовая точка транскрипции РНК-полимераза прокариотов состоит из пяти разных субъединиц. Четыре из них образуют агрегат, называемый корферментом (от лат. сог — сердце, сердцевина), катализирующий образование фосфоднэфирных связей между нуклеотидами в РНК- Пятая субъединица, называемая о-фактором или о-субъединицей, легко отделяется от кор-фермента. Эта а-субъединица как бы выбирает стартовую точку транскрипции, связываясь с промотором. Затем.к а-фактору, выбравшему место транскрипции, присоединяется кор-фермент. и начинает транскрипцию. Неясно, что вызывает разъединение двойной спирали ДНК в месте транскрипции. Возможно, эту функцию тоже выполняет РНК-полимераза, а может быть, есть специальный белок (типа расплетающего, как прн репликации),

У зукариотов имеется три РНК-полимеразы: I, II н III. Это белки, состоя­щие из нескольких субъединиц и отличающиеся друг от друга по специфич­ности транскрипции. РНК-Пол имераза I ответственна за транскрипцию генов рРНК, РНК-полимераза II — за тРНК и 5S рРНК, а РНК-полимера­за III участвует в синтезе предшественника мРНК. Очевидно, структура трех разных типов РНК'-полимераз зукариотов предусматривает специфи­ческий выбор транскриптонов, содержащих информацию о структуре рРНК, тРНК и полипептидной цепи.

РНК-Полимеразы наращивают цепь всегда только в направлении 5'-»-3'. поэтому 5'-конец содержит всегда трифосфат (Ф~Ф~Ф—), а 3'—свободный ОН. Начинается синтез всех цепей РНК либо о фффА, либо с фффГ, которые специфически спариваются со стартовыми основаниями разных транскрип­тонов.

Элонгация транскрипции происходит при скольжении РНК-полимеразы вдоль матрицы ДНК, Каждый следующий нуклеотид спари­вается с комплементарным основанием в ДНК-матрице, а РНК-полнмераза «скрепляет* его с растущей цепью РНК фосфодиэфирными связями. Скорость элонгации составляет примерно 40—50 нуклеотидов в секунду,

Терминация транскрипции происходит после достижения РНК-полнмеразой нуклеотидных последовательностей ДНК, являющихся стоп-сигналами. Считают, что такими стоп-сигналами в транскриптоне могут быть поли(А) последовательности, поскольку в транскриптах на З'-конце обнаруживаются комплементарные им поли (У) последовательности. Выделен н специальный фактор.терминации — р-фактор, который является белком. Он обрывает транскрипцию, каким-то образом взаимодействуя с термини­рующими последовательностями транскриптона. Благодаря терминаторам цепи РНК образуются только определенной длины.

По мере того как транскрипция подходит к концу, синтезированная РНК отделяется от ДНК. Первичные продукты транскрипции, т. е. РНК, являются полными копиями (в комплементарном изображении) транскрипто­нов ДНК. А значит, в новосинтезированиой РНК имеются информативные и неинформативные участки, Причем неинформатнвиые участки, несущие определенные функции в транскриптоне ДНК. очевидно, не нужны а РНК и являются своеобразными издержками транскрипции. Да и перенесены они в РНК потому, что процесс транскрипции непрерывен, а «выборочное» ко-пирование только информативных (структурных) участков транскриптонов вряд ли возможно. Первичные транскрнпты нужно освободить от неинфор­мативного груза и оставить только информативную часть молекул РНК. Поэтому первичный транскрнпт называют РНК-предщестненннком. Прн транскрипции образуется в основном три типа предшественников РНК:

1) предшественник мРНК, или гетерогенная ядерная РНК (сокращенно Пре -мРНК или ГнРНК), содержащая мРНК, использующуюся в цитоплазме как матрица при синтезе белка;

2) предшественники рРНК (пре-рРНК). содержащие 18S рРНК и 28S рРНК у эукариотов и, соответственно, 16S и 23S рРНК у прокариотов;

3) предшественник тРНК (пре-тРНК).

В ядре эукариотов асе предшественники связываются с белками, об­разуя рибонуклеопротеиды.

 

Билет 60

 

Обратная транскрипция характерна для так называемых ретровирусов — обширной группы вирусов, различающихся как по биологи­ческим свойствам (в частности, по способности вызывать злокачествен­ные опухоли), так и по морфологии. К данной группе относятся хоро­шо известные вирус иммунодефицита человека, вирус саркомы Рауса. Их вирионы содержат фермент обратную транскриптазу (РНК-за-висимую ДНК-полимеразу). Когда вирус попадает в клетку-хозяина, с помощью обратной транскриптазы осуществляется синтез ДНК с ис­пользованием в качестве матрицы вирусной РНК. Новосинтезированная (одноцепочечная) ДНК при участии ферментов клетки-хозяина превращается в двунитевую структуру в результате достраивания ком­плементарной ДНК (кДНК). Эта двунитевая ДНК встраивается в ге­ном клетки-хозяина с помощью специфических рекомбинационных механизмов, где она может в течение длительного времени (в ряду поколений) оставаться в скрытом неэкспрессируемом состоянии. Од­нако под действием определенных факторов (ионизирующие излуче­ния, канцерогенные агенты и т.д.) эти бездействующие гены могут активироваться и способствовать превращению клетки в раковую

8. Генная инженерия

Генная инженерия — это направление в молекулярной генетике по разработ­ке методов конструирования нужных генов и внедрению нх в клетку хозяина с целью изменения ее генетических свойств,

В настоящее время методы генной инженерии используются для генетического конструирования видов, т. е. соединения генов разных организмов (вируса и бактерии, вируса и зукариотов), направленного улучшения наследственных качеств организма (селекция), промышленного получения белков, являющихся продуктом действия пересаженных в клетку генов и т. д.

Методы генной инженерии включают следующие основные стадии:

1) получение интересующего гена, т. е. фрагмента ДНК;

2) соединение этого гена с так называемой векторной молекулой, спо­собной доставить ген в клетку хозяина и тем обеспечить репликацию чу­жеродного гена;

3) введение полученной гибридной ДНК в клетку реципиента;

4) отбор клеток, где размножается (клонируется) введенный чужерод­ный ген.

Получение интересующего гена. Получают требуемые гены или химиче­ским, или ферментативным способом. Прямой химический синтез гена можно провести, если известна последовательность в нем нуклеотидов. Успехи химии позволяют получить подобным способом ген практически любой длины. Во втором случае предварительно или выделяют в очищенном виде мРНК на тканей (так получены мРНК глобина, овальбумина, иммуноглобулинов и т. д.)^ или синтезируют химическим путем нужную мРНК. Далее мРНК используют как матрицу для ферментативного, синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции. Для этой цели использу­ется РНК-завнсимая ДНК-полимераза, или обратная транскрнптаза. Сначала с помощью обратной траскрнптавы на мРНК образуется однонитевая кДНК, а затем с помощью ДНК-полныеразы достраивается вторая нить кДНК-

Получение гибридной ДНК. Вектором называется часть гибридной ДНК. обеспечивающая проникновение и репликацию ее в клетке-хозяине. В ка­честве вектора применяются плазмиды, умеренные фагн, вирусы. Гибридную ДНК получают путем разрезания молекулы вектора специальными фермен­тами (рестрнктазамн) и соединения его с чужеродным геном с помощью ДНК-лнгазы, '

Перенос гибридной ДНК и клонирование генов. После получения гиб ридной ДНК ее вносят в среду, где находятся клетки-реципиенты. Наиболее частым объектом является кишечная палочка. Для улучшения проникнове­ния гибридной ДНК в клетки их обрабатывают различными способами (например, растворами СаС1а). Клетки, в которых начинается размножение генов, транскрибирование и транслирование, отбираются. Индикатором функ­ционирования пересаженного гена является соответствующий белок. Зна­чительная часть этих белков выделяется во внеклеточную среду, их легко можно получить, например, осадив клетки центрифугированием. Подобными методами была осуществлена пересадка многих генов, в том числе гена ин­сулина, соматотропина, овальбумина и др. Это открывает возможность про­мышленного получения белковых лекарственных препаратов геннойнженерным методом.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

· специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

· быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

· конструирование рекомбинантной ДНК;

· гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью;

· клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

· введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Ген соматостатина был получен на основе сведений о первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот. Использованный в этой работе подход оказался весьма перспективным для получения и многих других пептидных гормонов.

В различных лабораториях в СССР и за рубежом были созданы штаммы Е. coli, синтезирующие в составе гибридных белков гормон роста человека (соматотропин), пептидные гормоны -- брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей-энкефалин и др.

Ген гормона роста человека длиной 584 п.н.-- наиболее длинный из искусственно синтезированных в настоящее время. Он был встроен в плазмиду, реплицирующуюся в Е. coli под контролем промотора триптофанового оперона.

Трансформированные полученной химерной плазмидой клетки Е. coli продуцировали при индукции промотора около 3 млн. молекул гормона роста человека в расчете на клетку. Этот полипептид, как было установлено в экспериментах на крысах с удаленным гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека.

В 1976г. Гилберт и Максам в Гарвардском университете, а также Сэнгер разработали быстрый метод химического анализа ДНК. Появилась реальная возможность опреде-лять последовательность до 1000 нуклеотидов в неделю силами одного исследователя.

В 1982-1985гг. стало возможно создать прибор для автоматического анализа нуклеиновых кислот (а значит и генов).

Еще один важнейший этап - это синтез биополимеров по установленной структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963г. Они используются в исследовательских лабораториях и в фармацевтической промышленности.

Метод химического синтеза генов обеспечил также возможность получения штаммов бактерий продуцентов инсулина человека, важного лечебного препарата для больных диабетом.

Таким способом получены и клонированы гены, кодирующие глобины человека, животных и птиц, белок хрусталика глаза быка, яичный белок, фиброин шелка, продуцируемый тутовым шелкопрядом, и др.

Этот же принцип был применен для получения, клонирования и экспрессии генов интерферона человека в бактериях. Интерферон - ценный лекарственный препарат, широко используемый для борьбы с вирусными инфекциями и лечения ряда других заболеваний, включая злокачественные опухоли. Интерферон вырабатывается в клетках животных и человека, но обладает выраженной видовой специфичностью.

За счет введения в векторную плазмиду сигнальных последовательностей, инициирующих синтез и РНК и белка, удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона в расчете на 1л суспензии бактерий. Это в 5000 раз больше, чем содержится в 1л крови доноров. Замена Е. coli на микробы некоторых других видов позволяет еще больше увеличить производительность такой «фабрики интерферона».

Генно-инженерная биотехнология лекарственных средств. Этот способ производства лекарственных препаратов в настоящее время освоен в лабо­раторных условиях и внедряется в фармацевтическую промышленность. Методы генной инженерии могут быть использованы только для получения белковых и пептидных препаратов. Пересадкой генов, кодирующих образо­вание инсулина, соматостатина, соматотропина и других белково-пептидных гормонов, в кишечную палочку были получены в культуральиой жидкости продукты деятельности пересаженных генов, т. ё. соответствующие белковые препараты. Особую ценность представляет разработка промышленной биотех­нологий производства инсулина, требующегося во все возрастающих коли­чествах. Возможность его получения традиционным способом — из поджелу­дочных желез крупного рогатого скота — ограничена, а химический синтез, осуществленный в лабораторных условиях, трудоемок и пока несовершенен.

Большой интерес для фармацевтической промышленности представляет новый способ биотехнологии нммунопрепаратов — антител, интерферона. Он основан на получении клеточных гибридов, которые могут производить анти­тела в пробирках. Для этой цели были-взяты клетки селезенки, продуцирую­щие антитела, но неспособные Долго жить в пробирке, и клетки опухолей, которые хорошо живут и размножаются в искусственной среде. Из них полу­чены клеточные гибриды, т. е. клетки, получившиеся не вследствие деления, а в результате слияния. Эти клеточные гибриды, названные гибридояами, унаследовали от клеток' селезенки способность синтезировать антитела, а от опухолевых клеток — быстро размножаться в искусственных условиях Весь процесс получения препаратов чистых антител и интерферона упрощается. Животным вводят соответствующие белковые вещества (иммунизируют) или заражают вирусом (для производства интерферона), берут от них клетки селезенки, получают гибридомы и соответствующие иммунопрепараты. В на­стоящее время многие фармацевтические фирмы производят иммунопрепараты подобным способом.

 

Билет 61

 

5. Молекулярные основы трансляции

При трансляции генетический текст мРНК переводится в линейную последо­вательность аминокислот полипептидной цепи белка. Поскольку продуктом трансляции является специфический белок, то процесс трансляции в равной степени можно назвать биосинтезом белка.

Процесс трансляции можно разделить на два этапа, которые имеют разную локализацию в клетке: рекогниция, или узнавание аминокислот, и собственно биосинтез белка. Рекогниция протекает в гиалоплазме, а биосинтез белка происходит на рибосомах.

Рекогниция, или узнавание аминокислот

Сущность процесса узнавания аминокислот состоит в том, чтобы соединить аминокислоту со своей тРНК. Структура тРНК обладает качествами потенци­ального «переводчика», так как в одной молекуле совмещены способности «читать» нуклеотидный текст (антикодон тРНК специфически спаривается с кодоном мРНК) и нести (на акцепторном конце) свою аминокислоту. Одна­ко соединяться со своей аминокислотой тРНК не может. Для этой цели в кле­точном соке имеются специальные ферменты, которые по существу выпол­няют роль «переводчиков», т. е. обеспечивают узнавание тРНК своей амино­кислоты.Эти ферменты называются аминоацил-гРНК-синтетазами (сокращен­но АРСазы). Они специфически узна­ют тРНК и аминокислоту, катализируя их соединение по реакции

Для этого процесса требуется АТФ (Mgz+ играет роль кофактора), энергия которой используется на образование макроэргической связи в аминоацнл-тРНК, т. е. в реакции происходит одновременно активирование аминокислоты С карбоксильного конца и присоединение её к гидроксилу (З'-ОН) аденозина акцепторного конца (ЦЦА) тРНК. АРСазы обладают спо­собностью выборочно использовать при узнавании ассортимент тРНК для данной аминокислоты, т. е. ведущим звеном узнавания является аминокисло­та, а к пей подгоняется своя тРНК (иди свои тРНК)

Далее тРНК путем простой диффузии переносят присоединенную к ней аминокислоту к рибосомам, где происходит сборка белка из аминокислот, поступающих в виде разных аминоацил-тРНК.


Поделиться с друзьями:

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...

Индивидуальные очистные сооружения: К классу индивидуальных очистных сооружений относят сооружения, пропускная способность которых...



© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!

0.082 с.