Электронно-микроскопическое изучение тонких срезов клеточных культур

Весь процесс приготовления электронно-микроскопических препаратов можно разбить на 6 основных этапов. Это: фиксация, обезвоживание, пропитка смолой и полимеризация, ультрамикротомирование - приготовление ультратонких срезов, контрастирование. В данном методическом пособии наиболее подробно будут рассмотрены первые четыре этапа, так как в случае культуры клеток они имеют некоторую специфику.

В силу особенностей просвечивающей электронной микроскопии, препараты представляют собой срезы материала толщиной 40-60 нм. Направление резки материала может представлять дополнительную информацию об ультраструктурном строении клеток и пространственном распределении внутриклеточных компонентов в живой клетке. Так различают три вида заливки материала, которые позволяют получать срезы 1) параллельные плоскости прикрепления клеток к субстрату, 2) перпендикулярные этой плоскости и 3) срезы клеток, ориетированных случайным образом. Для первых двух случаев клетки выращиваются на кусочках специальной подложки (Film, Agar), которые затем вместе с клетками проходят пробоподготовку для электронной микроскопии. В случае если подложка ориентирована параллельно плоскости ножа, получают плоско-параллельные срезы клеток. Этот тип ориентации образцов часто используется для исследования цитоскелета клеток и связанных с ним структур. Однако этот подход требует высокого уровня навыков ультрамикротомирования, так как количество срезов, которые можно получить с таких образцов ограниченно толщиной клетки, особенно той области, которая является с одной стороны максимально обширной, а с другой максимально информативной в плане насыщенности цитоплазматическими органелами. В зависимости от морфологии клеток, размер этой области значительно варьируется, а в случае распластанных клеток, как на-пример фибробласты, может составлять несколько микрометров.

  Подложка с клетками может также быть оринтирована перпендикулярна плоскости ножа. В этом случае получаются срезы клеток, захватывающие верхнюю и нижнюю плазматические мембраны, что позволяет проводить качественный и количественный анализ ультраструктуры клеток в вертикальном направлении. Особенно популярен этот вид ориентирования образцов при исследовании ультраструктур, отвественных за прикрепления клеток к субстрату. Но в данном случае ультрамикротомирование захватывает как сами клетки так и подложку, на которой они росли. Так как твердость подложки и смолы, в которую заключен образец, значительно отличаются, это создает трудности при ультрамикротомировании образцов и влияет на качество препаратов.

  Перечисленные методы приготовления безусловно дают дополнительные данные для исследователей, однако сопряженные с ними трудности, часто делают их менее привлекательными для использования. Наиболее простым методом приготовления клеток является их трипсинизация, как было описано выше, фиксация и заключение в агарозные блоки. Однако при трипсинизации меняется морфология клеток, реорганизуется цитоскелет, также как нарушаются межклеточные контакты.

  Одним из оптимальных компромиссов является метод, который позволяет провести стандартную пробоподготовку большого количества клеток, ориентированных случайным образом, но сохранивших морфологию, характерную для прикрепленной культуры. При этом методе клетки фиксируются непосредственно в культуральном сосуде, без предварительного открепления от субстрата, затем снимаются при помощи скребка (рис. 12) и заключаются в агарозу. С использованием последнего метода будут рассмотрены все этапы приготовления препаратов культуры клеток для просвечивающей электронной микроскопии.

Рис. 12. Снятие клеток скребком после фиксации в культуральном сосуде без предварительной трипсинизации.

Фиксация. Перед фиксацией клетки отмывают от культуральной среды 2 раза по 5 мин фосфатным буфером. Время воздействия фосфатного буфера необходимо минимизировать, чтобы не внести изменения в морфологию клеток. В качестве фиксатора используется 2,5% раствор глютарового альдегида на натрий какодилатном буфере (0,1М рН 7,2). Внимание! Растворы натрий какодилата ядовиты! Следует избегать вдыхание их паров и попадание в организм через рот и кожу!

  В силу монослойного характера культуры, время фиксации при комнатной температуре составляет 30 мин. Удобно, что в таком фиксаторе материал можно хранить несколько дней при +4⁰ С, что позволяет проводить накопление материала для последующей пробоподготовки. Клетки отмываются от фиксатора тем же буфером 3 раза по 5 минут, соскребают скребком, добавляют буфер и осаждают центрифугированием. Время и скорость центрифугирования как правило составляет 1000 оборотов/мин 5 мин, но в некоторых случаях, когда клетки снимаются обширными участками, эти параметры приходится подбирать экспериментально.

Заключение суспензии клеток в агарозу. Один из способов иммобилизации мелких объектов в фиксированном объеме является заключение их в агарозу, что позволяет в дальнейшем отказаться от осождения клеток центрифугированием. Застывшая агароза создает крупнопористый гель, через который легко проникают водные растворы и смолы, поэтому этот подход широко используется в электронной микроскопии клеток, дрожжей и т.д. Для этого 2% раствор агарозы, доводится до кипения в микроволновой печи, смесь охлаждается до 37⁰ С, и при помощи водного термостата поддерживается при такой температуре на протяжении всего времени манипуляций с клетками. Предварительно необходимо прогреть до 37-40^О С носик пипетки со срезанным кончиком, для того чтобы предотвратить полимеризацию агарозы на охлажденном носике. Смешав в носике равные объемы 2% агарозы и осадка фиксированных клеток, полученную смесь выдавливают тонкой полоской на охлажденную до +4⁰С фольгу. Застывшая смесь формирует объемную полоску, которая затем разрезается лезвием на блоки длиной 3-4 мм. Полученные блоки переносятся во флакон с буфером комнатной температуры для предотвращение высыхания материала.

.

Постфиксафия. Следующий этап - постфиксация образцов в четырехокиси осмия - OsO4. Известно, что этот фиксатор взаимодействует с липидами по месту двойных связей. Образование поперечных связей вызывает сшивку молекул липидов, что снижает их растворимость и предотварящает экстракцию в процессе обезвоживания образцов в спиртах и ацетоне. В преапаратах, не прошедших постфиксацию в четырехокиси осмия, наблюдается негативное изображение всех мембраных струтур. Они выглядят как светлые линии, ограниченные прилежащим материалом. Что касается взаимодействия OsO4 с белками, то в этом вопросе ясности еще нет. По-видимому, OsO4 способствует образованию попречных связей между молекулами белков, реагируя главным образом с триптофаном, цистеином и гистидином. Четырехокись осмия продается в запаенных ампулах, содержащих, как првило, по 1 г вещества. Концентрированный раствор OsO4 -4% готовят заранее, растворяя вещество в дистилированной воде. Раствор для фиксации содержит 1% раствор OsO4 на натрий какодилатном буфере (0,1М, 7,2 рН). Продолжительность фиксации при комнатной температуре составляет 1 час или в течении ночи при 4^ОС. Затем образцы тщательно отмываются дистиллированной водой 3 раза по 5-7 минут.

Дегидратация. Дегидратация или обезвоживание образцов проводится в растворах спиртов возрастающей концентрации. Рекомендуется приготовить растворы заранее, некоторые исследователи предпочитают использовать растворы спиртов охлажденные до 4^ОС, для предотвращения экстракции различных компонентов клеток. Обезвоживание проводится по следующей схеме:

30^{0 -} 15 мин,

50^{0 -} 15 мин

70⁰ - 15 мин

96⁰ - 15 мин

100⁰ спирте - 15 мин