Особенности работы с культурой клеток

ВВЕДЕНИЕ

Тканевые и клеточные культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня. Использование культур клеток для решения целого ряда актуальных задач, стоящих перед медициной и биологией, основано на сохранении жизнеспособности клеток, выделенных из живого организма, возможности выращивать клетки, ткани, небольшие органы (или их части) животного, включая человека, или растения вне организма.

Одним из преимуществ клеточной культуры перед другими объектами исследования является возможность продолжительного наблюдения за жизнедеятельностью клеток, за состоянием отдельных клеточных органелл, за процессами, идущими в клетках, фиксировать состояние культуры с учетом количественных и качественных параметров.

Кроме того, использование данного методического подхода делает возможным решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций. Также он помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка", что делает перспективным использование клеточных культур в выявлении вирусов, обладающих онколитической активностью, способных подавлять неопластические процессы в организме млекопитающих и человека.

Для этих целей необходимы комплексные исследования с применением вирусологических, молекулярно-биологических и микроскопических методов, включая электронную микроскопию.

В связи с этим задачей данного методического пособия явилось ознакомление заинтересованной аудитории с основами культуральной работы и способами подготовки клеточных культур, использованным в эксперименте, к электронно-микроскопическому исследованию.

ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК

Преимущества метода

Прежде чем принять решение использовать клеточные культуры в качестве объекта или средства исследования, необходимо убедиться, что те преимущества, которые исследователь при этом получает, перекроют сопряжённые с данным методом трудности.

К преимуществам метода можно отнести следующее:

§ Главное преимущество культивируемых клеток - это возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа.

§ Существенно, что при работе с культурами клеток в эксперименте используются здоровые клетки, и они сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента. При опытах на целом животном состояние почек, например, можно оценить лишь в конце эксперимента, и к тому же обычно лишь качественно.

§ Культуры клеток представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях. Более того, исследователь может изменять эти условия в определённых пределах, что позволяет ему оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов - рН, температуры, концентрации аминокислот, витаминов и др. Рост может быть оценен в течение короткого периода времени либо по увеличению числа или размеров клеток, либо по включению радиоактивных предшественников в клеточную ДНК.

§ Существенные результаты могут быть получены при использовании очень небольшого числа клеток. Эксперименты, требующие для выяснения того или иного вопроса использования 100 крыс или 1000 человек, могут быть с равной статистической достоверностью поставлены на 100 культурах на покровных стёклах. Т. о. одна клетка может заменить целую клинику больных. Это является важным преимуществом, когда дело касается человека, и, кроме того, снимает многие этические проблемы, возникающие при необходимости использовать для эксперимента большую группу животных.

§ Поскольку клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций, то при работе с ними радиоактивные предшественники, яды, гормоны и др. могут быть введены в заданной концентрации и в течение заданного периода. Количество этих соединений может быть на порядок меньше, чем при экспериментах на целом животном. Исчезает также опасность того, что исследуемое соединение метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками. При использовании клеточных культур, как правило, бывает нетрудно установить, что при определённой концентрации добавленное в культуру вещество находится в контакте с клетками в течение данного периода времени. Это обеспечивает получение реальных значений скорости включения или метаболизма исследуемых соединений.

Помимо перечисленных выше преимуществ, клеточные культуры обладают рядом важных свойств, наличие которых является необходимым условием для решения многих поставленных перед исследователем задач. К ним можно отнести:

1. Однородность клеток, происходящих чаще всего от одной родительской пары клеток, и обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками.

2. Отсутствие структурной организации, гистотипическая целостность и связанные с ней биохимические признаки.

3. Размножение клеток с большим выходом биомассы.

4. Отсутствие дифференцированности.

5. Возможность клонирования, селекции, получения чистых клеточных линий, изучения или видоизменения свойств клеток и закрепление этих свойств.

6. Возможность получения количественного результата.

Подготовка бокса к работе

Различные манипуляции с культурами клеток проводят в специальном помещении - стерильном боксе. Полы и стены этого помещения должны быть моющимися (в идеале - кафельными) и не содержать материалов, накапливающих пыль. Влажную уборку проводят с использованием дезинфицирующих агентов. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами.

При длительном воздействии УФО лучи вызывают гибель всех бактерий. Бактерии погибают очень быстро, а споры грибов значительно медленнее. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30 минут за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов.

Непосредственно перед работой необходимо протереть внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом, разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, пинцет, серологические пипетки, резиновую спринцовку и культуральную посуду.

Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересевом клеточных культур проводят в ламинарах. Ламинарный бокс (ламинар) - приспособление для работы в стерильных условиях (рис. 1).

 

 

Рис. 1. Ламинарный бокс 2-го класса защиты.

Асептические условия в ламинаре создаются с помощью отсекающего потока воздуха. Ток воздуха, проходя через хепа-фильтры ламинара, движется к исследователю, что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов.

При работе с культурами животных клеток требования к стерильности более жесткие по сравнению с растительными культурами, поскольку вероятность контаминации выше.

Не рекомендуется в одних и тех же боксах вести работы с микробиологическими объектами и культурами клеток. Микроорганизмы более устойчивы к внешним факторам, и простерилизовать после работы с ними помещение гораздо труднее.

Все изложенное выше касается работ с непатогенным материалом. Уровни защиты при работе с патогенным материалом иные, и они требуют обеспечения большей безопасности.

Стерилизация

Существуют разные методы стерилизации: с помощью влажного пара, сухого пара, облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации.

 

Стерилизация посуды. Большинство клеточных культур в лабораторных условиях выращивают в культуральных матрасах, чашках Петри одно- или многоразового использования. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу (рис. 2, а). Чтобы избежать заражения стерильных предметов из воздуха, перед стерилизацией их закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов, колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами:

Посуду выдерживают в автоклаве (рис. 2, б) под давлением в течение 20-40 минут при температуре 100-130°С. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы - 20-40 минут, при 1 атм. - 15 минут.

а                                              б

Рис. 2. Оборудование для стерилизации инструментов. а: автоклав Euroklav 23 V-S (Евроклав); б: - универсальный сушильный шкаф Memmert серии UNB.

 

При сухом способе стерилизации посуду, завернутую в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140°С в течение 2 часов, при температуре 180°С - 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.

 

Стерилизация инструментов. Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т.д.) стерилизуют в сушильном шкафу. Шприцы и ножницы удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают. При работе все операции следует проводить в непосредственной близости от зажженной горелки, чтобы обеспечить максимальную защиту растворов от заражения.

 

Стерилизация материалов. Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25-30 мин.

 

Холодная стерилизация. Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм.

Виды культур клеток

Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочисленных структурных элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под контроля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особенностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.

Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo.

В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования различают несколько видов переживающих и растущих культур тканей и клеток. Наибольшее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологической практики.

Различают два основных вида однослойных клеточных культур: первичные и перевиваемые.

Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.

Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином — полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и других клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.

Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Усовершенствование техники культивирования клеток значительно расширило возможности получения перевиваемых клеточных линий из самых разнообразных тканей животных и человека. При этом не был обнаружен возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации к неограниченному росту in vitro, т.е. к трансформации.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo в результате развития патологического процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной.

Не все злокачественные новообразования способны давать начало перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С трудом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскоклеточного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравнительно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачественных опухолей нервной системы.

Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных и перевиваемых клеток.

 

Рис. 3. CO2 инкубатор CCL-170 CelCulture.

Подготовка сеточек для электронно-микроскопического исследования суспензий

Прежде, чем говорить о конкретных методах исследования материала, содержащего вирусы и имеющего жидкую консистенцию, следует привести наиболее популярные среди микроскопистов приемы, позволяющие поместить объект в электронный микроскоп.

Наиболее удобным способом изучения суспензий в просвечивающем электронном микроскопе является нанесение ее на тонкую пленку-подложку, лежащую на медной или никелевой электронно-микроскопической сеточке (рис. 11).

 

Рис. 11. Сеточки, используемые для изучения образцов в трансмиссионном электронном микроскопе (слева – бленд).

 

Важным пунктом подготовки образца к электронно-микроскопическому исследованию является подготовка блендов или сеточек и нанесение на них пленки-подложки. Следует учитывать, что попадание чужеродных частиц на пленку на этом этапе является существенным фактором, приводящим к артефактам в последующих измерениях. Поэтому, важной процедурой является очистка сеточек и блендов от химического загрязнении.

Мытье бленд или сеток: поместить бленды или сетки в 30% соляную кислоту на 1 мин. при комнатной температуре; промыть бленды в дистиллированной воде 10 раз; промыть бленды в химически чистом ацетоне 3 раза и высушить на воздухе; хранить бленды в герметично закрытой емкости, чтобы избежать попадания пыли.

В том случае, если сетки используют повторно, перед процедурой промывания их обрабатывают ультразвуком. Сетки помещают в стеклянную колбу с дихлорэтаном и погружают в ультразвуковую ванну, наполненную водой. При использовании ультразвуковой ванны с пьезокерамическим преобразователем с выходной мощностью 0,06 кВт обработку проводят при 37 или 44 кГц в течение 10 - 15 мин. При использовании ванн с большей мощностью время обработки можно снижать пропорционально мощности, но не меньше 5 мин.

 

В качестве подложки для суспензий широко используются коллодиевые, формваровые, кварцевые, углеродные и другие пленки, которые можно приготовить в лаборатории самостоятельно или готовые приобрести в фирме, торгующей расходными материалами для электронной микроскопии.

Пленка-подложка, выполняющая роль предметного стекла в световом микроскопе, должна быть по возможности более прозрачной. Для этого она должна изготавливаться из вещества с малым удельным весом и с низкой рассеивающей способностью, быть достаточно прочной, чтобы выдерживать все необходимые манипуляции, изменение давления, электронную бомбардировку и нагревание. Подложка не должна заряжаться под действием электронной бомбардировки.

Наиболее просты методы получения пленок с помощью 2% растворов коллодия или формвара (поливинилформальдегид).

Ниже приведены способы приготовления таких пленок.

Приготовление коллодиевой пленки. На дно воронки с горизонтальными стенками и краном снизу помещают стеклянный фильтр, а на него фильтровальную бумагу, на которой раскладывают электронно-микроскопические сеточки. Затем ее заполняют водой на 1-2 см выше уровня бумаги. Пипеткой на поверхность воды наносят каплю раствора коллодия в амилацетате (или амиловом эфире уксусной кислоты). Через 2-3 мин полученную пленку снимают, удаляя вместе с ней возможные пылинки с поверхности, и вновь наносят 1 каплю. После испарения растворителя сливают воду, открыв кран воронки, В результате пленка ложится на сеточки. Сеточки подсушивают и переносят в чашки Петри (или специальные контейнеры для хранения электронно-микроскопических сеток).

Приготовление формваровой пленки:

Для приготовления пленки используют 0,3% раствор формвара в дихлорэтане (хлороформе). Для этого 30 мг формвара помещают в мерную колбу с притертой крышкой и добавляют туда 10 мл химически чистого дихлорэтана. Полное растворение достигается за 3 дня. Можно использовать также 2% раствор формвара в хлороформе. Раствор хранят в темноте!

Затем последовательно выполняют следующие действия:

· опустить чистое предметное стекло в емкость с формваром на 5-10 сек;

· вынуть стекло и поставить его ребром на фильтровальную бумагу для удаления излишков формвара, высушить в течение 1 мин;

· процарапать препаровальной иглой прямоугольник по краю стекла;

· в широкую емкость (например, кристаллизатор), налить дистиллированную воду до образования выпуклого мениска;

· удалить пыль с поверхности воды с помощью стеклянной палочки или пипетки. Удаление пыли обязательно, иначе пыль попадет на формваровую пленку;

· коротко подышать на стекло с формваровой пленкой и медленно погрузить его в емкость с водой. В процессе погружения формваровая пленка отделится от стекла;

· с помощью пинцета поместить вымытые бленды на поверхность пленки. Пленка с сетками вылавливается на чистое предметное стекло, которое помещают в чашку Петри для последующего высушивания.

Приготовление углеродной пленки. Часто используют также наиболее подходящие по своим физико-химическим свойствам углеродные пленки. Их получают термическим испарением углерода в вакууме. Углеродные пленки аморфны, химически инертны, гидрофобны, прочны и хорошо переносят электронную бомбардировку.

Испарение углерода производят в вакуумных установках при разрежении 10-5–10-8 мм. рт. ст. В качестве источника углерода применяют спектрально чистые стержни диаметром 2–6 мм. Конец одного угольного стержня затачивается в виде острого конуса, а второй стержень спиливается по наклонной плоскости. Наклонная плоскость стержня располагается таким образом, чтобы основной поток атомов углерода направлялся в сторону предметного стекла, на которое напыляется углерод. При пропускании тока силой около 20А в месте контакта происходит резистивный разогрев стержней и испарение углерода.

Обычно слой углерода наносят на пленку из поливинилового спирта, покрывающую предметное стекло. Для оценки толщины напыляемой пленки рядом с предметным стеклом помещают кусочек белого фарфора с каплей диффузионного масла. При напылении фарфор постепенно темнеет, а под каплей масла остается белым. Требуемая толщина пленки 10 – 20 нм получается при окрашивании фарфора в коричневый цвет.

После напыления предметное стекло с двойной пленкой извлекают из вакуумной установки, насекают пленку острым лезвием на квадратики со стороной 3 – 10 мм и погружают предметное стекло в чашку Петри, наполненную горячей водой. При этом поливиниловый спирт быстро растворяется и углеродная пленка всплывает на поверхность. При помощи пинцета под квадратики подводят медные или никелевые сеточки (или бленды), вылавливают пленку и помещают на фильтровальную бумагу для высушивания.

Если очень тщательно очистить поверхность стеклянной пластинки, то можно напылять углерод непосредственно на нее и отделение углеродной пленки проводить в горячей воде.

Рис. 13. Выявление рутениевым красным кислы х углеводны х соединени й в гликокаликс е клеток и во внеклеточно м матрикс е. Электроннограмма. Бар соответствует 1 мкм.

с тем, что рутениевый красный плохо проникает в биологический материал (мол. вес 858,5, высокий электроположительный заряд) его добавляют непосредственно в глютар альдегидрый фиксатор в концентрации 0,5 мг/мл. В результате использования этого контрастирующего агента, на препаратах хорошо виден гликокаликс клеток, внеклеточный матрикс, а также внутриклеточные кислые мукоиды.

Подготовка опухолевых клеточных линий, зараженных ВБН, для электронномикроскопического анализа

В качестве примера методического подхода подготовки культур клеток для электронно-микроскопического анализа, приведен протокол исследования, целью которого было выявления механизмов взаимодействия ВБН с опухолевыми клетками.

 

Используемые в работе клеточные линии были посажены на 6-ти луночные планшеты. Через сутки после посадки были заражены ВБН..

Забор материала производили через 3 часа, сутки, 5 дней, 10 или 12 (для ВБН «Адыгея» и «Голубиный» соответственно) после инфекции.

Пробоподготовку проводили по модифицированной нами стандартной методике, что позволило в большей степени сохранить структуру культуральных клеток.

Клетки фиксировали через 3 часа, 1 сутки, 5 суток и 10 суток после обработки вирусом. Фиксацию проводили в 2,5%-ном глутаральдегиде на 0,1 М Na-какодилатном буфере и в 2,5% глутаральдегиде на 0,1 М Na-какодилатном буфере с добавлением рутениевого красного (0,1 М).

Клетки инкубировали с фиксатором 1 час, затем аккуратно снимали их покровным стеклом с лунок и переносили в пробирки.

Пробирки центрифугировали 5 минут при 4200 об./мин., затем убирали фиксатор и заливали клетки 2%-ным раствором агарозы.

С помощью пастеровской пипетки суспензию клеток в агарозе переносили на охлаждающий столик, застывшие агарозные блоки нарезали лезвием на кусочки объемом 1 мм³ .

Полученные агарозные блоки с клетками отмывали 0,1 М Na-какодилатным буфером и проводили дофиксацию 2%-ным раствором OsO₄.

Материал, фиксированный без рутениевого красного, инкубировали с 1%-ным водным раствором уранилацетата в течение 12 часов при температуре +4.

Далее материал обезвоживали в серии спиртов восходящей концентрации (30°, 50°, 70°, 90°, 96°), ацетоне и пропитывали смесью ацетона и эпоксидной смолы (3:1, 1:1, 1:3), а затем чистой смолой.

Материал заливали в смесь эпоксидных смол (Epon 812, Epon DDSA, Epon MNA) с катализатором DMP30 и проводили полимеризацию при температуре +60°С в течение 48 часов.

С полученных блоков делали ультратонкие срезы толщиной 50-60 нм на ультрамикротоме Leica UC6 (Германия) и помещали их на никелевые сеточки.

Срезы клеток, предварительно инкубированных с уранилацетатом, контрастировали цитратом свинца по Рейнгольдсу.

Срезы клеток, предварительно инкубированных с рутениевым красным, контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнгольдсу.

Образцы просматривали под электронным микроскопом Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении120 kV.

ЛИТЕРАТУРА

1. Адамс Р., Методы культуры клеток для биохимиков. Москва, Издательство "Мир", 1983, 262 с.

2. Балашов Ю. С., Миккау Н. Е., Изучение живых животных в растровом электронном микроскопе, "Природа", 1977, № 1;

3. Киселев Н. А., Электронная микроскопия биологических макромолекул, М., 1965;

4. Миронов А. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. - СПб.: Наука, 1994.

5. Гайер Г. Электронная гистохимия. Москва, Издательство "Мир", 1974, 488

6. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976, 224 с.

7. Животная клетка в культуре под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. – М.: 2000.

8. Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Вирусы, вироиды и микоплазмы растений: К 34 / Учебное пособие.- М.: Изд-во РУДН, 2003 – с. 157

9. Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989, 333 с.

10. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.: Мир, 1983. — 536 с.

11. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине.Спб «Наука» 1994 400 с.

12. Оленов Ю.М., - 1976 - "Новые методы культуры животных тканей".

13. Сергеев В. А. Репродукция и выращивание вирусов животных. - М.: Колос, 1976, 303 с.

14. Синдо Дайзуке. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. - Москва: Техносфера, 2006.

15. Темников Д.А., Мезина З.Р., Александрова И.С., Ларионова Н.Л. «Основы культивирования клеток животных». Интернет-курс. 2000 – 2003. Доступен на сайте http://www.ksu.ru/nilkto/cell/author.html.

16. Уикли Б., Электронная микроскопия для начинающих.Москва, Издательство "Мир", 324.

17. Уосли Д. Новые методы культуры животных тканей. Перевод с английского Фридлянской И.И., под редакцией Оленова Ю.М., Москва, Издательство "Мир",255.

18. Alberts B., Bray D., Lewis J. et al. Molecular biology of the cell: third edition / Garland Publ. Inc., N.Y. & London. - 1994.

19. Animal Cell Culture: A Practical Approach / Ed. John Masters, 2000.

20. Electron microscopy of enzymes. Principles and methods, v. 1—2, N. Y., 1973—74.

21. Harrison M.A., Rae I.F. General Techniques of Cell Culture, 2001.

22. Freshney R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, 2000.

23. Langdon S. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, 2003.

24. Tribe М. A., Eraut M. R., Snook R. K., Basic biology course, book 2 — Electron microscopy and cellstructure, Camb., 1975;

25. Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://www.study.online.ks.ua/

 

ВВЕДЕНИЕ

Тканевые и клеточные культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня. Использование культур клеток для решения целого ряда актуальных задач, стоящих перед медициной и биологией, основано на сохранении жизнеспособности клеток, выделенных из живого организма, возможности выращивать клетки, ткани, небольшие органы (или их части) животного, включая человека, или растения вне организма.

Одним из преимуществ клеточной культуры перед другими объектами исследования является возможность продолжительного наблюдения за жизнедеятельностью клеток, за состоянием отдельных клеточных органелл, за процессами, идущими в клетках, фиксировать состояние культуры с учетом количественных и качественных параметров.

Кроме того, использование данного методического подхода делает возможным решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций. Также он помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка", что делает перспективным использование клеточных культур в выявлении вирусов, обладающих онколитической активностью, способных подавлять неопластические процессы в организме млекопитающих и человека.

Для этих целей необходимы комплексные исследования с применением вирусологических, молекулярно-биологических и микроскопических методов, включая электронную микроскопию.

В связи с этим задачей данного методического пособия явилось ознакомление заинтересованной аудитории с основами культуральной работы и способами подготовки клеточных культур, использованным в эксперименте, к электронно-микроскопическому исследованию.

ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК

Преимущества метода

Прежде чем принять решение использовать клеточные культуры в качестве объекта или средства исследования, необходимо убедиться, что те преимущества, которые исследователь при этом получает, перекроют сопряжённые с данным методом трудности.

К преимуществам метода можно отнести следующее:

§ Главное преимущество культивируемых клеток - это возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа.

§ Существенно, что при работе с культурами клеток в эксперименте используются здоровые клетки, и они сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента. При опытах на целом животном состояние почек, например, можно оценить лишь в конце эксперимента, и к тому же обычно лишь качественно.

§ Культуры клеток представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях. Более того, исследователь может изменять эти условия в определённых пределах, что позволяет ему оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов - рН, температуры, концентрации аминокислот, витаминов и др. Рост может быть оценен в течение короткого периода времени либо по увеличению числа или размеров клеток, либо по включению радиоактивных предшественников в клеточную ДНК.

§ Существенные результаты могут быть получены при использовании очень небольшого числа клеток. Эксперименты, требующие для выяснения того или иного вопроса использования 100 крыс или 1000 человек, могут быть с равной статистической достоверностью поставлены на 100 культурах на покровных стёклах. Т. о. одна клетка может заменить целую клинику больных. Это является важным преимуществом, когда дело касается человека, и, кроме того, снимает многие этические проблемы, возникающие при необходимости использовать для эксперимента большую группу животных.

§ Поскольку клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций, то при работе с ними радиоактивные предшественники, яды, гормоны и др. могут быть введены в заданной концентрации и в течение заданного периода. Количество этих соединений может быть на порядок меньше, чем при экспериментах на целом животном. Исчезает также опасность того, что исследуемое соединение метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками. При использовании клеточных культур, как правило, бывает нетрудно установить, что при определённой концентрации добавленное в культуру вещество находится в контакте с клетками в течение данного периода времени. Это обеспечивает получение реальных значений скорости включения или метаболизма исследуемых соединений.

Помимо перечисленных выше преимуществ, клеточные культуры обладают рядом важных свойств, наличие которых является необходимым условием для решения многих поставленных перед исследователем задач. К ним можно отнести:

1. Однородность клеток, происходящих чаще всего от одной родительской пары клеток, и обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками.

2. Отсутствие структурной организации, гистотипическая целостность и связанные с ней биохимические признаки.

3. Размножение клеток с большим выходом биомассы.

4. Отсутствие дифференцированности.

5. Возможность клонирования, селекции, получения чистых клеточных линий, изучения или видоизменения свойств клеток и закрепление этих свойств.

6. Возможность получения количественного результата.