Способы идентификации вирусных антигенов методами электронной микроскопии

При электронной микроскопии разных биологических объектов применяют специальные методы приготовления препаратов. Это необходимо для выявления отдельных компонентов изучаемых объектов (клетки, бактерии, вируса и т. д.), а также для сохранения их структуры в условиях высокого вакуума под пучком электронов. При помощи электронной микроскопии изучается внешняя форма объекта, молекулярная организация его поверхности, с помощью метода ультратонких срезов исследуется внутреннее строение объекта.

В зависимости от цели и задач, стоящими перед исследователем, подготовка материала для электронно-микроскопического анализа может значительно отличатся. Для электронно-микроскопического изучения патогенетических изменений, возникающих в тканевых и клеточных структурах под воздействием вирусов, можно использовать тонкие срезы пораженной ткани или суспензии, содержащие инфекционный агент и объект его воздействия.

Рис. 10. Выявление морфологии вирионов гриппа A/swine/1976/31 (H1N1) в бронхолегочных смывах мыши на 3 сутки поле инфицирования методом негативного контрастирования (http://racing-digest.ru/a21022503.htm).

 

В случае исследования суспензий обнаружить вирусы можно с помощью негативного окрашивания, приводящего к очерчиванию компонентов вириона электронно-плотным материалом (рис. 10). Метод эффективен при высокой концентрации вируса в исследуемых образцах, как, например, в фекалиях или везикулярной жидкости.

Если содержание вирусных частиц в образцах невелико, вероятность обнаружения вируса можно увеличить, концентрируя его ультрацентрифугированием или агрегируя вирус специфическими антителами. Последний метод удобен и для идентификации вирусов.

Подготовка сеточек для электронно-микроскопического исследования суспензий

Прежде, чем говорить о конкретных методах исследования материала, содержащего вирусы и имеющего жидкую консистенцию, следует привести наиболее популярные среди микроскопистов приемы, позволяющие поместить объект в электронный микроскоп.

Наиболее удобным способом изучения суспензий в просвечивающем электронном микроскопе является нанесение ее на тонкую пленку-подложку, лежащую на медной или никелевой электронно-микроскопической сеточке (рис. 11).

 

Рис. 11. Сеточки, используемые для изучения образцов в трансмиссионном электронном микроскопе (слева – бленд).

 

Важным пунктом подготовки образца к электронно-микроскопическому исследованию является подготовка блендов или сеточек и нанесение на них пленки-подложки. Следует учитывать, что попадание чужеродных частиц на пленку на этом этапе является существенным фактором, приводящим к артефактам в последующих измерениях. Поэтому, важной процедурой является очистка сеточек и блендов от химического загрязнении.

Мытье бленд или сеток: поместить бленды или сетки в 30% соляную кислоту на 1 мин. при комнатной температуре; промыть бленды в дистиллированной воде 10 раз; промыть бленды в химически чистом ацетоне 3 раза и высушить на воздухе; хранить бленды в герметично закрытой емкости, чтобы избежать попадания пыли.

В том случае, если сетки используют повторно, перед процедурой промывания их обрабатывают ультразвуком. Сетки помещают в стеклянную колбу с дихлорэтаном и погружают в ультразвуковую ванну, наполненную водой. При использовании ультразвуковой ванны с пьезокерамическим преобразователем с выходной мощностью 0,06 кВт обработку проводят при 37 или 44 кГц в течение 10 - 15 мин. При использовании ванн с большей мощностью время обработки можно снижать пропорционально мощности, но не меньше 5 мин.

 

В качестве подложки для суспензий широко используются коллодиевые, формваровые, кварцевые, углеродные и другие пленки, которые можно приготовить в лаборатории самостоятельно или готовые приобрести в фирме, торгующей расходными материалами для электронной микроскопии.

Пленка-подложка, выполняющая роль предметного стекла в световом микроскопе, должна быть по возможности более прозрачной. Для этого она должна изготавливаться из вещества с малым удельным весом и с низкой рассеивающей способностью, быть достаточно прочной, чтобы выдерживать все необходимые манипуляции, изменение давления, электронную бомбардировку и нагревание. Подложка не должна заряжаться под действием электронной бомбардировки.

Наиболее просты методы получения пленок с помощью 2% растворов коллодия или формвара (поливинилформальдегид).

Ниже приведены способы приготовления таких пленок.

Приготовление коллодиевой пленки. На дно воронки с горизонтальными стенками и краном снизу помещают стеклянный фильтр, а на него фильтровальную бумагу, на которой раскладывают электронно-микроскопические сеточки. Затем ее заполняют водой на 1-2 см выше уровня бумаги. Пипеткой на поверхность воды наносят каплю раствора коллодия в амилацетате (или амиловом эфире уксусной кислоты). Через 2-3 мин полученную пленку снимают, удаляя вместе с ней возможные пылинки с поверхности, и вновь наносят 1 каплю. После испарения растворителя сливают воду, открыв кран воронки, В результате пленка ложится на сеточки. Сеточки подсушивают и переносят в чашки Петри (или специальные контейнеры для хранения электронно-микроскопических сеток).

Приготовление формваровой пленки:

Для приготовления пленки используют 0,3% раствор формвара в дихлорэтане (хлороформе). Для этого 30 мг формвара помещают в мерную колбу с притертой крышкой и добавляют туда 10 мл химически чистого дихлорэтана. Полное растворение достигается за 3 дня. Можно использовать также 2% раствор формвара в хлороформе. Раствор хранят в темноте!

Затем последовательно выполняют следующие действия:

· опустить чистое предметное стекло в емкость с формваром на 5-10 сек;

· вынуть стекло и поставить его ребром на фильтровальную бумагу для удаления излишков формвара, высушить в течение 1 мин;

· процарапать препаровальной иглой прямоугольник по краю стекла;

· в широкую емкость (например, кристаллизатор), налить дистиллированную воду до образования выпуклого мениска;

· удалить пыль с поверхности воды с помощью стеклянной палочки или пипетки. Удаление пыли обязательно, иначе пыль попадет на формваровую пленку;

· коротко подышать на стекло с формваровой пленкой и медленно погрузить его в емкость с водой. В процессе погружения формваровая пленка отделится от стекла;

· с помощью пинцета поместить вымытые бленды на поверхность пленки. Пленка с сетками вылавливается на чистое предметное стекло, которое помещают в чашку Петри для последующего высушивания.

Приготовление углеродной пленки. Часто используют также наиболее подходящие по своим физико-химическим свойствам углеродные пленки. Их получают термическим испарением углерода в вакууме. Углеродные пленки аморфны, химически инертны, гидрофобны, прочны и хорошо переносят электронную бомбардировку.

Испарение углерода производят в вакуумных установках при разрежении 10-5–10-8 мм. рт. ст. В качестве источника углерода применяют спектрально чистые стержни диаметром 2–6 мм. Конец одного угольного стержня затачивается в виде острого конуса, а второй стержень спиливается по наклонной плоскости. Наклонная плоскость стержня располагается таким образом, чтобы основной поток атомов углерода направлялся в сторону предметного стекла, на которое напыляется углерод. При пропускании тока силой около 20А в месте контакта происходит резистивный разогрев стержней и испарение углерода.

Обычно слой углерода наносят на пленку из поливинилового спирта, покрывающую предметное стекло. Для оценки толщины напыляемой пленки рядом с предметным стеклом помещают кусочек белого фарфора с каплей диффузионного масла. При напылении фарфор постепенно темнеет, а под каплей масла остается белым. Требуемая толщина пленки 10 – 20 нм получается при окрашивании фарфора в коричневый цвет.

После напыления предметное стекло с двойной пленкой извлекают из вакуумной установки, насекают пленку острым лезвием на квадратики со стороной 3 – 10 мм и погружают предметное стекло в чашку Петри, наполненную горячей водой. При этом поливиниловый спирт быстро растворяется и углеродная пленка всплывает на поверхность. При помощи пинцета под квадратики подводят медные или никелевые сеточки (или бленды), вылавливают пленку и помещают на фильтровальную бумагу для высушивания.

Если очень тщательно очистить поверхность стеклянной пластинки, то можно напылять углерод непосредственно на нее и отделение углеродной пленки проводить в горячей воде.