Диагностические сыворотки. Классификация. Получение. Применение.

Для обнаружения неизвестного антигена в исследуемом материале или в чистой культуре необходимы известные антитела – диагностические сыворотки.

Классификация диагностических сывороток:

1. По способу получения:

1-й путь: Гипериммунизация животных-продуцентов соответствующим микроорганизмом (АГ) → Забор крови у животного-продуцента →Получение сыворотки крови, содержащей АТ к соответствующему микроорганизму (АГ) (поликлональные АТ)

2-й путь: Путем гибридомной биотехнологии →Гипериммунизация животного-продуцента соответствующим микроорганизмом (АГ) → Выделение из организма животного плазмоцитов,

продуцирующих антитела нужной специфичности (АОК) →Слияние плазмоцитов с клетками миеломы in vitro, получение гибридомы → Получение моноклональных антител

2. По специфичности

А)Поливалентные (полиспецифические)

Содержат АТ к разным антигенам (антигенным детерминантам) микроорганизма

Б) Моновалентные (моноспецифические)

Содержат АТ к одному конкретному антигену (антигенной детерминанте) микроорганизма

Способы удаления из сывороток лишних АТ:

Метод Кастеллани

Сорбционные методы (например, аффинная хроматография)

Метод адсорбции по Кастеллани

К нативной сыворотке животного (неадсорбированной), содержащей многочисленные АТ различной специфичности, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят АГ, на которые наработались эти «ненужные» АТ. Антигены связывают антитела и выпадают с ними в осадок, который, в дальнейшем, удаляется. Полученная таким образом сыворотка содержит только “нужные” АТ и называется адсорбированной.

Аффинная хроматография

Сыворотка крови иммунизированного животного пропускается через колонку с носителем, к которому ковалентно «пришиты» АГ к «нужным» антителам. Специфические по отношению к АГ антитела сыворотки связываются с ним, а все другие (“ненужные”) антитела проходят через колонку. Вслед за этим специфически связанные антитела смывают с колонки кислым или щелочным раствором, получая таким образом именно “нужные” АТ, то есть адсорбированную сыворотку.

3. По назначению

1. Агглютинирующие

2. Преципитирующие (+ антитоксические)

3. Люминесцирующие

4. АТ, меченные ферментом (АТ, конъюгированные с ферментом)

5. Суспензионные АТ

6. АТ, адсорбированные на частицах латекса

7. АТ, адсорбированные на клетках стафилококка

8. Лизирующие (например, гемолитическая)

Получение диагностических сывороток

Все диагностические сыворотки получены либо путем гипериммунизации животных -продуцентов АГ или при помощи гибридомной биотехнологии (моноклональные антитела). Причем, для получения преципитирующих сывороток используется иммунизация животных растворимым АГ (молекулярным), а для получения всех остальных – корпускулярным.

Агглютинирующие сыворотки Получены путем гипериммунизации животных-продуцентов корпускулярным АГ или при помощи гибридомной биотехнологии (моноклональные антитела). Применяются в РА для сероидентификации.

Преципитирующие сыворотки Получают путем гипериммунизации животных-продуцентов растворимым АГ или при помощи гибридомной биотехнологии (моноклональные АТ). Применяют в РП для сероиндикации. Антитоксические преципитирующие сыворотки получают аналогично, но гипериммунизация животных проводится анатоксином. Их применяют в РП в геле для сероидентификации.

Люминесцирующие сыворотки К FC-фрагменту полученных АТ присоединяют молекулу флуоресцирующего красителя,например, ФИТЦ (флуоресцеинаизотиоцианат) - флуоресцентная метка. Применяются в РИФ для сероиндикации и серодиагностике (антиглобулиноваясыворотка, меченная ФИТЦ).

АТ, меченные ферментом (конъюгированные с ферментом) К FC-фрагменту молекулы АТ присоединяют ферментную метку (например, пероксидазу). Применяются в сероиндикации и серодиагностике в ИФА.

Суспензионные антитела Получены путем адсорбции АТ FC-фрагментами на эритроцитах человека или барана, предварительно обработанных формалином или танином для улучшения адсорбционных свойств последних. Применяются в РПГА для сероиндикации.

АТ, адсорбированные на частицах латекса Содержат АТ, адсорбированные FC-фрагментами на микросферах латекса. Применяются в реакции латекс-агглютинации.

АТ, адсорбированные на клетках стафилококков Содержат АТ, адсорбированные FC-фрагментами на клетках стафилококков. Применяются в реакции коагглютинации.

Лизирующие сыворотки Пример – гемолитическая сыворотка, содержащая АТ к эритроцитам барана (получена путем иммунизации кроликов эритроцитами барана). Применяются в РСК.

Для обнаружения неизвестных АТ в сыворотке крови пациента необходимы заведомо известные АГ (диагностикумы).

Классификация диагностикумов:

Корпускулярный диагностикум

Представляет собой взвесь клеток микроорганизмов или вирусных частиц, инактивированных физическими или химическими способами; редко – живые клетки.

Некорпускулярный диагностикум

Содержит отдельные АГ (молекулы), полученные путем экстракции (чаще всего химической) из клеток микроорганизмов или вирусных частиц.

Эритроцитарные диагностикумы

Содержат эритроциты человеческой или бараньей крови, нагруженные АГ микроорганизма, т.е. АГ микроорганизма адсорбированы на поверхности эритроцитов. Для создания прочной связи АГ с поверхностью эритроцитов последние предварительно обрабатывают формалином и танином.