Клинические формы дерматофитий и их наиболее частые возбудители

Болезни	Наиболее частые возбудители
Микоз волосистой части головы, бровей и ресниц	Trichophyton species, Microsporum species
Фавус	Т. schoenleinii, T. violaceum (редко), М. gypseum (редко)
Керион	Т. verrucosum, T. mentagrophytes
Микоз бороды и усов	Т. rubrum, T.mentagrophytes, T. verrucosum
Микоз гладкой кожи лица и тела	Т. rubrum and any other dermatophytes и некоторые другие дерматофиты
	Т. concentricum
Микоз складок	Е. floccosum, Т. rubrum, T. mentagro­phytes
Микоз ногтей	Т. rubrum, T. mentagrophytes, редко дру­гие трихофитоны
Микоз кистей	Т. rubrum, E. floccosum, T. mentagro­phytes
Микоз стоп	Т. rubrum, Т. mentagrophytes, E. floccosum

 

Лабораторная диагностика

Диагноз дерматомикозов ставят на основании клинической картины и результатов лабораторных исследований.

Лабораторные исследования состоят из следующих этапов:

I. Взятие и транспортировка патологического материала; 

II. Микроскопия материала;

III. Выделение и идентификация чистой культуры возбудителя с определением чувствительности к химиопрепаратам;

IV. Серологические и аллергологические исследования.

I. Взятие и транспортировка патологического материала.

Правильное взятие материала в значительной степени влияет на успех микроскопии и получение культуры, так как не все че­шуйки и волосы из очагов поражения содержат элементы гриба. Патологический материал следует брать в максимально возмож­ном количестве из очагов, не подвергавшихся местному лечению.

Кожные чешуйки соскабливают с активных периферических краев очага поражения или в межпальцевых промежутках с помо­щью стерильного, слегка затупленного скальпеля. Обрывки мацерированного, белесоватого рогового слоя и покрышки пузырьков берут пинцетом. Поверхностные корочки и чешуйки в центре микотических очагов содержат значительно меньше грибных элемен­тов и менее пригодны для исследования. Дня взятия материала с шелушащихся очагов на гладкой коже и у детей можно применять прозрачную липкую ленту.

Глубокие слои пораженной ногтевой пластинки соскабливают скальпелем, извлекая рыхлые роговые массы. Для взятия мате­риала из пораженных ногтей используют маникюрные ножницы, скальпели, пинцет, препаровальные иглы. Получение тонко раз­мельченного патологического материала облегчает дальнейшие исследования.

При поражении волос эпиляционным пинцетом извлекают рас­положенные на периферии очага деформированные, белесоватые, обломанные волосы, изменившие цвет и потерявшие эластичность.

Исследование лампой Вуда

Лампа Вуда является инструментом, облегчающим диагности­ку и взятие исследуемого материала при клинически выраженных и субклинических формах грибковых инфекций, а также использу­ется для контроля излеченности. Лампа Вуда - это ультрафиолето­вая лампа со стеклянным фильтром, состоящим из силиката бария с 9 % окисью никеля и пропускающим длинноволновые УФ-лучи 365 нм, используется для облучения в темноте с расстояния до по­верхности 20 см. Лампа Вуда вызывает флюоресценцию, индуци­руемую у некоторых микроорганизмов.

Ярко-зеленая флюоресценция наблюдается при поражении волос дерматофитами рода Microsporum (M. audouinii, M. canis, М. ferrugenium, Mdistortum). Метод позволяет быстро и легко про­вести скриннинг значительных контингентов людей (детей) при по­дозрении на микроспорию. Ограничивает применение лампы Вуда увеличение этиологической роли Т. tonsurans (слабая флюоресцен­ция) и других нефлюоресцирующих видов дерматофитов.

При разноцветном лишае (М. furfur) пораженная кожа имеет золотисто-желтую флюоресценцию, при эритразме (возбудитель -Corynebacterium minutissimum) - красную, при поражении ран бак­териями рода Pseudomonas - ярко-зеленую. Артефакты при иссле­довании могут быть обусловлены использованием некоторых кос­метических и антифунгальных мазей.

Для взятия материала при стертых формах микозов волосистой части головы можно использовать стерильный вельвет, ковровый лоскут, стерильную щетку для мытья рук с нанизанным на ее ворс на глубину 0,3-0,5 мм бинтом, создающим при вычесывании волос фильтроподобный слой, на котором задерживаются чешуйки и во­лосы. Для посева бинт расстилают на питательной среде до появ­ления роста гриба.

Патологический материал можно собирчть в стерильные чашки Петри; между двумя стерильными предметными стеклами, скреп­ленными резинками и завернутыми в бумагу; в пакеты из черной бумаги, чтобы лучше видеть чешуйки и волоски. Следует избегать использования пергаментной и вощеной бумаги, так как при раз­ворачивании может произойти потеря и распространение патоген­ного материала.

Транспортировка и пересылка материала производятся в сте­рильных биксах с сопроводительными документами. В сопроводи­тельной бумаге следует указывать:

1) ФИО, возраст, пол больного;

2) учреждение и ФИО врача;

3) дату взятия и характер материала;

4) предполагаемый диагноз и № истории болезни.

Для взятия и исследования материала желательно иметь сле­дующее оборудование: микроскоп световой, фазовоконтрастное устройство, осветитель, окулярный микрометр, микологические лопатки, бактериологические петли, препаровальные иглы, скаль­пели, пинцеты эпиляционные, пинцеты хирургические и анатоми­ческие, ножницы, шпатели, газовые горелки или спиртовки, чашки Петри, предметные и покровные стекла, пробирки бактериологи­ческие, пробирки центрифужные, предметные стекла с лунками, колбы, воронки, пипетки мерные, глазные, пастеровские, палочки стеклянные, карандаши по стеклу, лупу.

Работа в микологической лаборатории, связанная с исследовани­ем инфекционного материала, должна проводиться в соответствии с существующими инструкциями по технике безопасности и противо­эпидемическому режиму. В лаборатории следует иметь шкафы для чистой посуды, инструментов, питательных сред, реактивов. Для де­зинфекции рабочих столов, стекол с патологическим материалом, защитных клеенок используют 5 % раствор хлорамина, раствор лизо­ла и другие средства, указанные в Инструкции МЗ СССР № 985-72 по проведению противоэпидемических и дезинфекционных меро­приятий при микроспории, трихофитии и фавусе. Инструменты и посуду после использования при взятии материала подвергают обез­зараживанию и тщательной механической очистке. Культуры грибов и патологический материал автоклавируют 30 мин при 120° или ки­пятят в течение часа. Рабочие столы и воздух в лаборатории стерили­зуют УФ лучами ртутно-кварцевой лампы.

Патологический материал исследуют в кратчайший срок после его взятия. Для этого его следует разделить на 3 части:

- для микроскопии;

- для получения культур;

- для повторного контрольного исследования.

II. Микроскопия патологического материала - наиболее про­стой и быстрый метод для установления наличия гриба в тканях. Для этого кожные и ногтевые чешуйки размельчают препароваль­ными иглами, а длинные волосы (при фавусе) делят на короткие фрагменты (0,1-1 мм) ребром нагретого скальпеля или прокален­ной препаровальной иглой. Размельченный материал помещают на середину предметного стекла, наносят 1—2 капли 10 % КОН и слег­ка подогревают над пламенем до появления белесоватого ободка по краю капли, не доводя до кипения, накрывают покровным стек­лом и оставляют на 5-10 мин (волосы, кожные чешуйки), 30-40 мин (ногтевые чешуйки) для мацерации и просветления.

При перегревании препарата, сильном надавливании или слишком длительной обработке происходят деформация волос и нарушение расположения спор и мицелия гриба. Чтобы обойтись без нагревания, препарат выдерживают в 20% КОН 30-60 мин. Препараты микроскопируют вначале под малым увеличением с опущенным конденсором или с прикрытой апертурной диафраг­мой для затемнения поля зрения; затем избранные места просмат­ривают при большом увеличении сухой системы с приподнятым конденсором. При незначительном количестве элементов гриба (в начале болезни) или при их нечеткости рекомендуется пользовать­ся фазово-контрастным устройством.

Кроме КОН, существует целый ряд растворов, применяющихся для просветления кератина роговых чешуек и волос: лактофенол (20 г 85 % молочной кислоты, 40 г глицерина, 20 мл дистиллиро­ванной воды, 20 г кристаллической карболовой кислоты и 0,05 г хлопчатобумажной синьки), хлорлактофенол (20 г кристалличе­ского хлоралгидрата, 10 г кристаллической карболовой кислоты, 10 г молочной кислоты), 10 % водно-спиртовый раствор сульфида натрия, 15 % КОН в 15 % диметилсульфоксиде на дистиллирован­ной воде. Оптимальными и приблизительно равноценными рас­творами, просветляющими кожные и ногтевые чешуйки, являются 10 % КОН, 15 % КОН+15 % ДМСО и 10 % Na2S.

Для обработки грубых роговых масс ногтей, чешуек кожи с подошв и ладоней и при массовых осмотрах применяют методы обогащения. Материал в центрифужных пробирках заливают 1,5-2 мл 20 % КОН, кипятят в водяной бане 30-60 мин, затем центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин или отстаивают 1 сутки. После сливания жидкости осадок переносят на предметное стекло пасте­ровской пипеткой и микроскопируют.

Ногтевые чешуйки рекомендуется обрабатывать PAS (periodic acid-Shiff) методом, который окрашивает гифы грибов в красный цвет.

Характер поражения волос дерматофитами позволяет опреде­лить родовую принадлежность гриба. Вид можно определите только по культуре.

Существуют следующие типы поражения волос дерматофитами: 

I. Trichophyton ectotrix - артроспоры располагаются непра­вильными цепочками снаружи волоса, окружая его в основании. Пораженные волосы не флюоресцируют. Tr. ectotrix имеет две разновидности: Тг. ectotrix megasporon (крупноспоровый, размер спор 8-12 мк), характерен для поражения Т. equinum, T. gallinae, Т. megninii, Т. rubrum, Т. verrucosum и Tr. ectotrix microides (мел­коспоровый, размер спор 3—5 мк), характерен для поражения Т. mentagrophytes.

2. Trichophyton endotrix - артроспоры размером 3-5 мк парал­лельными цепочками располагаются только внутри волоса. Пора­женные волосы не флюоресцируют: они скручиваются и ломают­ся, оставляя короткие пеньки или «черные точки». Данный тип по­ражения характерен для Т. tonsurans, T. violaceum, а также для аф­риканских дерматофитов Т. gourvilii, T. soudanense, T. yaoundei.

3. Microsporum - артроспоры размером 2-3 мк (нечетко видны при малом увеличении) беспорядочно-мозаично располагаются внутри волоса и белесоватым чехлом окружают его стержень сна­ружи. Пораженные волосы ярко флюоресцируют; обламываясь, они оставляют пеньки 5-8 мм. Такой тип поражения волос харак­терен для М. audouinii, M. canis, M. distortum, M. ferrugineum. При надавливании на покровное стекло в препарате из пораженного микроспорумами волоса иногда можно видеть мицелиальную ба­хромку - так называемую «кисть Адамсона». Волосы, пораженные М. gypseum, M. fulvum, M. nanum, M. vanbreuseghemii, не флюо­ресцируют, споры при этом более крупные (5-8 мк) и видны при малом увеличении.

4. Trichophyton - характерное для фавуса полиморфное пора­жение волос септированными гифами мицелия разной ширины и артроспорами различной величины, расположенными внутри во­лос, содержащих пузырьки воздуха и капельки жира. Волосы не заполнены грибковыми элементами, остаются длинными; слабо флюоресцируют под лампой Вуда. Однако не следует основывать диагноз только на наличии в волосе пузырьков воздуха и капель жира, так как они иногда наблюдаются и при других типах пора­жения. Кроме поражения волос по типу Achorion, для фавуса ха­рактерно образование скутул,- желтых корочек, содержащих гифы и споры гриба. Данный тип поражения вызывают Т. schoenleinii, Т. violaceum, M. gypseum.

В чешуйках гладкой кожи, пораженной дерматофитами, можно видеть гифы септированного ветвистого мицелия шириной 2-4 мк, иногда цепочки из округлых или многоугольных артроспор разме­ром 4-7 мк. В ногтевых чешуйках чаще наблюдают цепочки или скопления артроспор и реже гифы мицелия.

Следует отличать от элементов гриба такие артефакты, возни­кающие в препаратах, как так называемый «мозаичный гриб» (рас­полагается по границам эпителиальных клеток, состоит из фрагмен­тов органической природы различного размера), удлиненные кри­сталлы щелочи (полигональная форма); исчезают при промывании препарата, для чего с одной стороны наносят каплю воды, а с дру­гой помещают кусочек фильтровальной бумаги и осторожно, чтобы не потерять материал, повторяют 2-3 раза, капли жира (различные размеры, отсутствие внутренней структуры), нити ваты (размер, го­могенность, неправильная форма, кисточка на конце).

В заключении по микроскопии патологического материала ука­зывают тип поражения волос, наличие или отсутствие мицелия и спор гриба в кожных и ногтевых чешуйках. Однако считают, что гифы дерматофитов в препаратах неотличимы от мицелия дрож-жеподобных или плесневых грибов. Поэтому для определения ви­да возбудителя нужно сочетать микроскопию патологического ма­териала с получением чистой культуры. При этом образцы патоло­гического материала следует культивировать и при отрицательных результатах микроскопии.

III. Культуральное исследование

Оно необходимо для выделения и идентификации возбудителя, для определения латентного дерматофитоза, носительства дерма-тофитов здоровыми лицами, выявления дерматофитов в окру­жающей среде и определения чувствительности культуры к химиопрепаратам

3.1. Получение чистой культуры.

Исследуемый материал следует максимально измельчить и засе­вать в минимальных количествах на скошенный агар в пробирках в 2-4 точки на расстоянии 1-2 см. Материалом одной пробы засевают не менее 2-3 пробирок (волосы) и 4-5 пробирок (кожные и ногтевые чешуйки) на две различные питательные среды. Для первичной изо­ляции дерматофитов предпочтительно использовать стандартную агаршованную среду Сабуро (SDA); 2 или 4 % глюкозы (глюкоза 20 или 40 г, пептон 10 г, агар 20 г, дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,0), сусло-агар (пивное сусло, разбавленное дистиллирован­ной водой до 7 % углеводов по Баллингу, агар 20 г) или среду Сабуро с антибиотиками: антибактериальные антибиотики (пенициллин: 50 мкг/мл+стрептомицин 50-100 мкг/мл или левомицетин 50 мкг/мл, или биомицин 200 ед/мл, гентамицин) и антиплесневой антибиотик актидион (циклогексимид) 0,1-0,4 мг/мл. Приготовление селектив­ных сред с антибиотиками - 200 000 ед кристаллического пеницил­лина растворяют в 10 мл стерильной воды, 1 мл этого раствора + 9 мл воды дают концентрацию 2000 мкг/мл. Добавление 2,5 мл этого раз­ведения к 100 мл растопленной и охлажденной до 50° среды дает концентрацию пенициллина 50 мкг/мл. Аналогично производят до­бавление в среду стрептомицина (1 г стрептомицина=1 млн.ед). Био­мицин добавляют растворением 1 таблетки (100000 ед) в 500 мл ос­тывающей среды. Левомицетин предварительно растворяют в 10 мл 70° этилового спирта и добавляют в среду до концентрации 50 мкг/мл. Актидион (антибиотик из Streptomyces griseus) - белый кристаллический порошок, термостабильный, хорошо растворимый в ацетоне. В 1 мл ацетона растворяют 10-50 мг актидиона, доводят до 2 мл дистиллированной водой и прибавляют к 100 мл остывающей среды. Актидион не влияет на рост дерматофитов и подавляет многие плесневые грибы, а также виды Candida и Cryptococcus. Поэтому при подозрении на этилогическую роль этих грибов посевы следует про­изводить также и на среды без актидиона.

Посевы инкубируют в термостате при 25-30-37° соответственно (чаще 30°) и исследуют еженедельно до 4 недель. При подозрении на Т. verrucosum половину засеянных пробирок следует инкубиро­вать при 37°, так как гриб быстрее растет при этой температуре. Первые признаки роста дерматофитов отмечают с 4 по 12 день ин­кубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования счи­тают отрицательными. В оптимальных условиях первичные культу­ры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7-10 день после посева, но в случае фавиформных грибов иногда только на 20-30 день. Первичные культуры растут сравнительно медленно и при использовании сред без антибиотиков могут быть подавлены более быстро растущими бактериями и плесневыми грибами. В от­личие от последних, колонии дерматофитов никогда не бывают черными, голубыми или зелеными. Важно соблюдать асептику при взятии и хранении материала, а также исследовать его в кратчай­ший срок. При появлении роста желательно произвести отсев с края первичной культуры на свежую среду для получения чистой куль­туры. Перед инкубацией засеянные и надписанные чашки Петри следует завернуть в полиэтилен или в бумагу для предотвращения быстрого высыхания и вторичного воздушного загрязнения.

3.2 Идентификация чистой культуры.

3.2.1. Характеристика колоний.

При описании колоний следует отмечать такие признаки как время появления и скорость роста колонии, ее размеры, цвет по­верхности и обратной стороны, характер поверхности и ее рельеф, форму и край колонии, ее консистенцию и наличие врастания в субстрат. Характеризуя колонию, указывают на ее отличия от ти­пичных штаммов, что важно для оценки полиморфизма данного вида гриба, а также для выявления атипичных штаммов и новых, редких в России видов.

3.2.2. Микроскопическое исследование культур.

При малом увеличении и сильном освещении можно исследо­вать край колонии через стекло пробирки, так как нити мицелия перемещаются на стекло. Наличие и расположение характерных морфологических элементов (конидии, спирали) в сочетании с культуральными признаками в раде случаев позволяют предвари-. тельно определить вид без приготовления микропрепарата или микрокультуры. При таком исследовании пробирку можно фикси­ровать рукой или использовать деревянную подставку с вырезом.

Для приготовления микропрепарата фрагмент культуры рас­щепляют микологической лопаточкой и препаровальной иглой на предметном стекле в капле жидкости (вода, раствор Люголя, лак-тофенол, этанол+вода 1:1, этанол+глицерин + вода 2:4:4) и накры­вают покровным стеклом. Культуру для исследования берут из центральной и периферической зоны колонии. Микроскопировать следует вначале под малым (*8), а затем под большим (*40) увели­чением сухой системы микроскопа. Элементы гриба измеряют с помощью окулярного микрометра, значение деления которого предварительно определяют объект-микрометром.

3.2.3. Микрокультуры готовят для исследования микроморфо­логии гриба с целью «го точной идентификации.

На центр покровного стекла наносят каплю жидкой среды, со­держащую грибные элементы, и устанавливают его каплей вниз на смазанное вазелином кольцо Вантигема или предметное стекло с лункой. Для предотвращения высыхания на дно вносят каплю воды. Можно приготовить микрокультуры в агаровых блоках. Для этого из агара вырезают квадраты размером 10x10 мм, высотой 2 мм и переносят их на предметное стекло. Культуру засевают посередине каждого ребра агарового квадрата, накрывают его покровным стек­лом и промежуток между покровным и предметным стеклом запол­няют предварительно расплавленным парафином для предотвраще­ния высыхания. Микрокультуры инкубируют во влажной камере (чашка Петри или эксикатор с увлажненной ватой).

При микроскопической характеристике культур следует учи­тывать септированность мицелия, наличие, характер и способ при­крепления макроконидий и микроконидий, а также структуру ми­целия и его образований - спиралей, гребешковых гифов, фавиче-ских канделябров. Наличие и характер хламидоспор не имеют ре­шающего диагностического значения.

3.2.4. Биохимические дифференциально-диагностические тесты.

При невозможности идентифицировать штаммы, основываясь только на их морфологических особенностях, применяют тесты для определения некоторых проявлений метаболической активно­сти грибов. Для лабораторной практики разработаны методы оп­ределения питательных потребностей и методы определения фер­ментативной активности дерматофитов.

Определение потребности в источниках питания и витаминах.

Основную минимальную среду (NH4NO3 1,5 г, глюкоза 40 г; MgS04 • 7НгО 0,5 г; КН2РС>4 1 г; агар Дифко 20 г; дистиллированная вода до 1000 мл) растворяют при нагревании и автоклавируют при 0,5 атм 15 мин. Витамины (тиамин 1 мг, i-инозит 250 мг, L-гистидин 150 мг, никотиновая кислота 10 мг) растворяют в 100 мл дистилли­рованной воды каждый, автоклавируют при 0,5 атм 15 мин и хранят в холодильнике. Перед опытом 2 мл того или иного витамина до­бавляют к 100 мл остывающей основной среды. Для определения способности ассимилировать углеводы их вносят в основную среду вместо глюкозы до конечной концентрации 1 %. Источники азоти­стого питания вносят в среду вместо NH4NO3. Контролем служат посевы на основную и обогащенную среду.

Кератинолитическая активность (Тест перфорации волос).

А) Мелко раздробленную очищенную почву стерилизуют в ав­токлаве 3 дня подряд по 1 часу при 1 атм. и помещают в чашки Петри ровным слоем в 3-4 мм. На поверхности почвы равномерно и не густо распределяют нарезанные на короткие фрагменты (15-20 мм) детские волосы, простерилизованные в автоклаве 2 дня подряд по 20 мин при 1 атм. На поверхность почвенно-волосяной среды наносят взвесь исследуемой культуры в 1-2 мл дистиллиро­ванной воды. Посевы инкубируют 4 недели при 22-27° с ежене­дельным увлажнением среды стерильной дистиллированной во­дой. Наличие органов-перфораторов или других форм кератиноли-зиса регистрируют путем еженедельной микроскопии волос, на которых происходит развитие культуры гриба.

Б) Полоску фильтровальной бумаги помещают на дно стерильной чашки Петри и покрывают стерильной дистиллированной водой. Вно­сят нарезанные стерилизованные волосы, 5-6 капель 1 % дрожжевого экстракта и взвесь исследуемой культуры. Инкубируют при 25° 4 недели. Еженедельно микроскопируют волосы на наличие конических органов - перфораторов волосяного стержня. Данный метод применя­ют для дифференциации Т. equinum, T. raentagrophytes, T. rubrum, a также для получения совершенных форм дерматофитов из почвы.

Дифференциальная среда с молоком, глюкозой и бромкрезол - пурпурным (ВСР + CCG + 0,5 % дрожжевого экстракта) позволяет дифференцировать виды дерматофитов по двум параметрам: за-щелачивание среды (голубая —> пурпурная) и зона просветления вокруг колоний за счет гидролиза молока.

Гемолитическую активность определяют на среде Сабуро рН 6,5 с фосфатным буфером и с 5 % дефибринированной бараньей крови. Эритроциты вносят в остывающий агар, и среду разливают по чаш­кам достаточно толстым слоем. После посева исследуемых культур чашки инкубируют 2 недели при 27°. О гемолитической способности судят по образованию вокруг колоний зоны просветления вследствие растворения эритроцитов. Зеленоватую окраску этой зоны расцени­вают как альфа-гемолиз, наличие прозрачной и бесцветной зоны -как бета - гемолиз. Контролем служат незасеянные чашки с 5 % кро-ч вяным агаром. Тест может служить для дифференциации Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также Т. tonsurans и Т. soudanense.

Определение уреазной активности (способности расщеплять мо­чевину) производят на среде Христенсена с мочевиной. Состав сре­ды: пептон 1 г, NaCl 5 г, КН2РО4 2 г, глюкоза 5 г, агар 20 г, дистилли­рованной воды до 1000 г. Ингредиенты среды растворяют при нагревании, рН доводят до 6,8 и добавляют 6 мл 0,2 % раствора фе­нол красного (0,2 г фенолрота растворяют в 20 мл нагретого этанола и прибавляют 80 мл нагретой дистиллированной воды). Среду стери­лизуют 20 мин при 0,5 атм, охлаждают до 50° и добавляют 100 мл водного раствора мочевины (стерилизованного через бактериальный фильтр или 15 мин при 0,5 атм). Среду разливают в пробирки, ска­шивают и посевы инкубируют 7 дней при 25°-30°. Результаты оце­нивают по наличию и сроку появления красного окрашивания среды, которое является показателем уреазной активности культур. Контро­лем служат незасеянные пробирки со средой. Тест применяют для дифференциации атипичных штаммов Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также для идентификации Т. gallinae, «африканских» трихофитонов и некоторых видов Microsporum.