Методы диагностики грибковых заболеваний

ГРИБКОВЫЕ

ЗАБОЛЕВАНИЯ КОЖИ

Учебное пособие

под редакцией профессора С.И. Данилова

Санкт-Петербург 2005

УДК 616.511: 616-002.828 (-052.63) (06)

Грибковые заболевания кожи. Учебное пособие под ред. проф. СИ. Данилова СПбГМА им. И.И. Мечникова - СПб: 2005. С. 124

В учебном пособии изложен материал по эпидемиологии, этиоло­гии и клиническому течению грибковых заболеваний кожи. Особое внимание уделено характеристике грибов, источникам инфекции и патогенезу развития дерматофитий. В пособии рассмотрены вопросы лабораторной диагностики и современных методов лечения.

Пособие предназначено для студентов медицинских вузов.

Учебное пособие составили сотрудники кафедры дерматовене­рологии СПбГМА им. И.И. Мечникова: проф. Данилов С.И.; до­центы — Пирятинская В.А., Грибанова Т.В., Смирнова О.Н., Клю-чарева С.В.; Ассистенты - Лалаева А.М., Карякина Л.А., Тернов-ская О.А., Гусева С.Н., Пирятинская А.Б., Петунова Я.Г., Смирно­ва И.О., Нечаева О.С., Белова Е.А.; доцент кафедры микробиоло­гии Васильев О.Д.

Рецензенты:

Соколовский Е.В., доктор медицинских наук, профессор, заве­дующий кафедрой дерматовенерологии с клиникой Санкт-Петербургского государственного медицинского Университета им. И.П. Павлова.

Барбинов В.В., доктор медицинских наук, профессор, замести­тель начальника кафедры кожных и венерических болезней Воен­но-медицинской академии.

Рекомендовано в качестве учебного пособия Ученым Советом СПбГМА им. И.И. Мечникова

© СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2005 г

© Кафедра дерматовенерологии, 2005 г

ВВЕДЕНИЕ

1. Актуальность проблемы

Дерматомикозы (грибковые заболевания) составляют большую группу заболеваний кожного покрова и слизистых оболочек, вы­зываемых внедрением и жизнедеятельностью растительных мик­роорганизмов - грибов.

Дерматомикозы представляют большой интерес в силу разно­образия не только возбудителей и вызываемой ими клинической картины, но, главным образом, своей склонностью к распростра­нению, обусловленной высокой контагиозностью возбудителей. Грибы принадлежат к классу низших растений, лишенных хлоро­филла и не способных ассимилировать углекислоту. Они широко распространены в природе, что объясняется условиями существо­вания их в качестве паразитов, условно-патогенных грибов и сапрофитов. Грибы отнесены к отдельному царству Fungi, или Myceta (грибы), одному из 5 царств эукарион. К царству Fungi отно­сят 4 отдела:

1) Chitridiomyceta, насчитывающий 800 видов, которые не вы­зывают микозы;

2) Zygomyceta имеют около 1000 видов, которые вызывают му-короз и эндомофтороз;

3) Отдел Ascomymyceta включает 32 тысячи видов, имеющих половую (репродуктивную) стадию жизненного цикла и около 14 тысяч вегетативную (внеполовую) стадию. Гифы аскомицетов имеют двухслойную клеточную оболочку, перегородки, половая стадия представлена аском (мешок или сумка), наполненным спо­рами. Аскомицеты являются возбудителями большинства микозов;

4) отдел Basidomyceta (базидомицеты) насчитывают около 15 тысяч видов. Имеют половую стадию размножения (споры) и вегетативную. Базидомицеты являются возбудителями криптококкоза, разноцветного лишая и других Malassezia-инфекций, белой пьедры и трихоспонороза.

Под именем дерматомицетов или дерматофитов (от греческих слов derma - кожа, mykes - гриб, phyton - растение) особое место занимают патогенные грибы, принадлежащие к низшим грибам - гифомицетам - нитчатым грибам, характеризующимся ните и спорообразованием; значительная часть дерматомицетов относится к классу Ascomycetes. Общей характерной чертой для дерматомице­тов является паразитирование их в коже или ее придатках - воло­сах, ногтях. Источником заражения грибковыми заболеваниями служат больной человек, а также больные животные. Заражение происходит как путем непосредственного контакта с больными, так и через предметы, находившиеся в соприкосновении с ними и зараженные грибами.

Попадая в организм человека или животного с волосами и че­шуйками во внешнюю среду, грибы могут проявлять свою жизне­деятельность и вирулентность в течение длительного времени, продолжающегося годами.

Попадание гриба на поверхность кожного покрова приводит к внедрению его в роговой слой. Последнее облегчается при нали­чии мацерации и микротравмы, а также тем обстоятельством, что роговой слой представляет собой не только благоприятную пита­тельную среду, но и оптимальную среду для паразитарных грибов. Некоторые виды грибов ограничивают свое местопребывание в коже исключительно роговым слоем. Другие же грибы, как на­пример, микроспорум и трихофиты, поражают также и придатки кожи - волосяные фолликулы, волосы и ногти.

По месту локализации внедрившихся грибов и по степени вос­палительной реакции различают поверхностные и глубокие (под­кожные) дерматомикозы.

Патогенное воздействие грибов не ограничивается исключитель­но кожным покровом с его придатками. Черногубовым Н.А. и Пеле­виной И.О. описаны случаи универсального поражения кожи и желу­дочно-кишечного тракта грибковой этиологии. Подавляющее боль­шинство грибковых заболеваний обладают высокой степенью зара­зительности. В эпидемиологическом отношении особое значение имеют трихофития, микроспория, фавус, микозы стоп и кистей, гене­рализованный микоз и онихомикозы. Наклонность дерматомикозов к широкому распространению, особенно среди детей, делают проблему борьбы с дерматомикозами особенно актуальной.

Возросло значение микозов как внутрибольничной инфекции. Особенно значительна роль микозов в трансплантологии, онкоге-матологии, неонатологии. Например, Candida spp. Вытесняют внугрибольничных возбудителей-бактерий. Группа микозов проч­но занимает место в структуре ВИЧ-ассоциированной патологии. Возрастающая значимость микозов заставляет совершенствовать методики их диагностики, лечения, в зависимости от возбудителей и форм инфекции.

2. Краткие исторические сведения о грибковых заболеваниях

Грибковые заболевания были известны человечеству очень давно. Академик О.Н. Подвысоцкая различала 3 периода в исто­рии наших знаний о грибковых заболеваниях.

Первый период, так называемый описательный, начинается с глубокой древности (Гиппократ, Цельс) до середины XIX века. Начало изучения микозов в медицине относится к античной эпохе. Молочница была описана Гиппократом и Галеном, фавус (парша) и инфильтративно-нагноительная трихофития - Цельсом, а совре­менное название дерматофитий (tinea) появилось в древнем Риме, когда были открыты первые возбудители грибковых заболеваний. В 1842 г. был описан возбудитель поверхностной трихофитии и микроспории. В 1846 г. - возбудитель разноцветного лишая.

Второй период в истории грибковых заболеваний простирается с половины до конца XIX века, чему способствовало изобретение микроскопа, развитие ботаники, а затем микологии. В этот период были открыты новые виды грибов: в 1839г. - гриб возбудитель фавуса, в 1842г. - поверхностной трихофитии и микроспории, в 1846 г. - возбудители разноцветного лишая, актиномикозы (1892) и бластомикозы (1894). Изучалась и описывалась вызываемая ими клиническая картина, производились поиски наиболее пригодных для роста грибов питательных сред, чем было положено начало изучения возбудителей гриба всех заболеваний в культурах (1899 г., Сабуро). На рубеже XIX-XX вв. были описаны почти все основные микозы человека и их возбудителей. Русский ученый Верюжский один из первых на основании многочисленных посе­вов грибов на питательных средах доказал, что грибковые заболе­вания вызываются различными грибами. Труды Верюжского име­ли исключительное значение для решения вопроса об этиологии грибковых заболеваний и для полного разгрома унитарной теории.

Третий период простирается с конца XIX столетия до настоя­щего времени. В этот период обращают на себя внимание работы по изучению токсинов грибов и иммунитета, а также серология грибковых заболеваний, вопросы их лечения, изучение которых привело к расширению арсенала лечебных средств.

Ведущее место в этот период заняла наша отечественная дерма­тология, представленная такими учеными как Павлов С.Т., Поспе­лов А.И., Никольский Н.В., Фридман Е.Ф., Богров С.Л., Черногу-бов Н.А., Картамышев А.И., Боголепов А.А., Подвысоцкая О.Н., Аравийский А.Н., Чубарова А.С., Ариевич A.M., Кашкин П.Н. и др.

3. Морфология грибов

Грибы являются растительными организмами. Наряду с водорос­лями они относятся к низшим растениям и отличаются от последних тем, что не содержат хлорофилла и не ассимилируют углерода.

Возбудители патогенных грибов (они изучены под микроско­пом) состоят из нитей различной длины и толщины, называемых гифами. Иногда они переплетаются между собой наподобие вой­лока. Сплетение нитей, или гиф, составляет вегетативное тело гриба и называется мицелием или грибницей. Нити мицелия могут разделяться поперечными перегородками на отдельные членики (клетки), как это наблюдается, например, у грибов - возбудителей трихофитии, в этом случае мицелий называют септированным. В других случаях поперечные перегородки могут отсутствовать -тогда нить мицелия представляется в виде одной разветвляющейся и разросшейся клетки, напоминающей собой полую трубку.

Нити мицелия имеют оболочку, которая состоит из целлюлозы, фунгина, хитиноподобного и кислотоупорного вещества. В оболоч­ке мицелиальной нити заключена грибная протоплазма, состоящая из органических и неорганических веществ. В протоплазме имеются вакуоли и различные включения: жир, гликоген, пигмент, фиброз­ные образования, кристаллоиды и смолистые вещества. В прото­плазме грибов заключены клеточные ядра в виде маленьких округ­лых образований неодинаковой величины, в которых наблюдаются явления митоза и прямого деления путем перешнуровки ядра. Хи­мический состав грибов отличается большим разнообразием. Сюда входят органические соединения - углеводы, белки, жиры, растительные кислоты (щавелевая, лимонная, уксусная, муравьиная и др.), ароматические соединения, эфирные масла, алкалоиды (муска-рин, эрготин и пр.), глюкозиды, а также неорганические соединения - соли натрия, калия, фосфора, железа, серы и др. Кроме того, в ве­гетативных телах грибов нередко находятся пигментные вещества сложного химического состава, придающие колониям грибов фио­летовую, красную, золотисто-желтую и другую окраску. Для био­химической активности грибов характерна их способность выделять ферменты, расщепляющие белки и жиры, углеводы.

В зависимости от условий внешней среды, в частности питания, мицелий грибов может иметь разнообразную форму. В одних случа­ях на протяжении нитей мицелия образуются перетяжки, что делает их похожими на стебли тростника. У некоторых грибов окончания мицелия бывают в виде коротких и толстых ответвлений и напоми­нают собой канделябры или же образуют переплетения, имеющие сходство с рогами северного оленя. Указанные формы мицелия обна­руживаются, главным образом, в чистых культурах. Мицелий, обна­руживаемый в патогенном материале, представляется более однооб­разным. В лабораторной диагностике помимо обнаружения мицелия важными являются споры, которые, по определению акад. О.Н. Под-высоцкой и проф. П.Н. Кашкина, представляют собой «комочки сгу­щенной протоплазмы, заключенные в более плотную и резко конту-рированную, иногда двойную оболочку», т.е. морфологически споры являются образованиями, возникшими в нитях мицелия и отделив­шимися от них, - это клетки воспроизведения грибов, которые явля­ются в то же время одной из стадий существования грибов и поддер­жания их биологического рода.

Размножение патогенных грибов происходит посредством спор, которые, будучи более устойчивыми, чем мицелиальные ни­ти, образуются, главным образом, при неблагоприятных условиях для развития жизни грибов. Даже по истечении длительного срока споры, попав в благоприятные условия, могут прорастать и обра­зовывать новый мицелий.

Возбудители грибковых заболеваний; представляют собой организмы, находящиеся в постоянном и тесном общении с внешней средой, ассимилируют вещества, необходимые для их

жизни. К числу последних в первую очередь относятся углерод, азот, минеральные соли.

Большое значение для роста и жизнедеятельности грибов име­ют белки и углеводы. Размножение углеводов обеспечивает по­требность грибов в углероде. Из углеродов наиболее легко усваи­ваются грибами глюкоза, мальтоза, левулеза и др. Азот грибы ус­ваивают из пептонов и аминокислот, а также из солей аммония. Из неорганических веществ для питания грибов необходимы соли ка­лия, железа, марганца, фосфора и др.

Усвоение питательных веществ грибами связано с их фермента­тивной деятельностью. Большинство патогенных грибов способно вырабатывать ферменты, разрушающие тканевые элементы. Из них особое значение имеют протеолитические ферменты, в частности, диастаза, переводящая белки в пептоны, также липаза, эмульгирую­щая и омыляющая жиры. Липаза играет также существенную роль в патогенезе развития дерматомикозов, растворяя кожный жир и об­легчая проникновение грибов в кожу. Реакция среды также имеет значение для роста и развития грибов. Еще Верюжский в своих рабо­тах показал, что колонии грибов лучше всего растут при слабо­кислой реакции среды. Однако границы кислотности среды, в кото­рой могут расти грибы, колеблются в довольно широких пределах. Жизненный цикл грибов состоит из двух фаз или стадий: половой (репродуктивной) и бесполой (вегетативной). Половая стадия жиз­ненного цикла грибов называется телеоморфой, бесполая - анамор-фой. Другим вариантом роста является почкование, когда происхо­дит отделение дочерней клетки от материнской. В репродуктивной фазе тело гриба имеет сложное строение и состоит из дифференциро­ванных клеток, имеющих специальные репродуктивные органы. Среди них выделяют структуры переживания, позволяющие перено­сить неблагополучные условия. Грибы размножаются при помощи спор. Споры образуются в результате простого митоза и мейоза. В первом случае тип спорообразования и стадия развития гриба назы­ваются бесполыми, а сами бесполые споры - конидиями. Во втором случае тип размножения называется половым, а само имя «споры» чаще применяется именно к половым спорам. Для многих плесневых грибов характерно наличие особых органов конидиогенеза (бесполого размножения). Отпочковывающиеся дочерние клетки дрожжевых грибов называют бластоконидиями.

Устойчивость грибов

Можно считать, что температурные границы роста грибов колеб­лются между 15° и 50° выше нуля. Наиболее благоприятной темпера­турой для роста грибов является температура 25-30° выше нуля.

По данным A.M. Ариевича, П.Н. Кашкина и др. авторов сол­нечный свет задерживает рост дерматофитов, так ежедневное в течение одного часа освещение грибов солнцем ведет к гибели грибов, как в культурах, так и в патологическом материале.

Резистентность дерматомицетов в отношении химических ве­ществ довольно высока. Известно, что после 10-минутного воздей­ствия формалина (2%), двууглекислой соды (10%), карболовой кислоты (2,5 %), при воздействии в течение нескольких секунд раствором хлорной извести (0,5 %) наблюдается гибель грибов. Столь же эффективное действие оказывает настойка йода (10%), анилиновые краски - фукорцин, метил-виолет, бриллиантовая зе­лень (1-2 %), салициловая и бензойная кислота (1 %).

В патологическом материале, особенно в волосах, грибы могут сохранять свою жизнеспособность в течение длительного времени. Академик О.Н. Подвысоцкая указывает, что грибы в волосах со­храняют свои патологические свойства в течение одного года, а в ногтевых пластинках и чешуйках - от 4 недель до полугода. Встречаются отдельные указания на жизнеспособность патоген­ных грибов в течение 3-8 лет (Иткин, Малышев).

Как показывают исследования, жизнеспособность грибов объ­ясняется наличием спор, устойчивых к внешним воздействиям, в то время как мицелии оказывается погибшим. Эта устойчивость спор в патологическом материале является чрезвычайно важным ' эпидемиологическим фактором. Существующее деление грибов на сапрофитов и условно-патогенных грибов представляется крайне условным. Поэтому следует выделить важные патогенетические факторы, способствующие переходу этих грибов в патогенное или, можно сказать, паразитарное состояние:

а) гипоавитаминозы,

б) эндокринопатии, особенно сахарный диабет,

в) дисбактериоз и другие заболевания желудочно-кишечного тракта,

г) состояние иммунодефицита, в частности ВИЧ-инфекция.

Дерматофитозы

Микозы кожи, вызванные мицелиальными и дрожжеподобными грибами, называются дерматомикозы.

Микозы ногтей, вызванные мицелиальными и дрожжеподобными грибами, называются онихомикозы.

Микозы кожи и её кератин-содержащих придатков, вызванные дерматофитами, называются дерматофитозы или дерматофитии

Дерматомикозы и онихомикозы, кроме дерматофитов, могут быть вызваны следующими грибами:

• Дерматомикозы

1. Candida spp.

2. Fusarium moniliforme

3. Trichosporon beigelii

4. Hendersonula toruloidea

• Онихомикозы

1. Scopulariopsis brevicaulis

2. Acremonium sp.

3. Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. glaucus, A. teereus, A. versicolor

4. Fusarium oxysporum

5. Geotrichum candidum

6. Candida albicans

7. Hendersonula toruloidea

8. Cephalosporium sp.

Дерматофитозы (английские синонимы «tinea» или «ringworm») - это наиболее распространенные поверхностные микозы человека и животных, при которых поражаются кератиновые ткани кожи, волосы и ногти. Они вызываются группой родственных мицелиаль-ных кератинофильных грибов, имеющих общее название «дермато-фиты» и способных использовать кератин в качестве источника пи­тания. К этой группе относят около 100 грибов, большинство из ко­торых является почвенными кератинофильными грибами, но только 42 вида признано достоверно существующими и действительно свя­заны с микозами человека. Из них 11 видов наиболее распростране­ны как возбудители дерматофитозов. Предполагается, что в процес­се эволюции почвенные грибы адаптировались к определенным хозяевам и постепенно сформировали существующие группы антропо, зоо- и геофильных дерматофитов.

Несовершенные формы дерматофитов подразделяются на 3 рода:

1. Род Epidermophyton - продуцирует только макроконидии при отсутствии микроконидий. Включает 2 вида, один из которых патогенен для человека.

2. Род Microsporam - продуцирует микроконидии и шорехова-тые макроконидии. Описано 19 видов, из которых 9 вызывают ин­фекции людей и животных.

3. Род Trichophyton - продуцирует гладкостенные макрокони­дии и микроконидии. Включает 22 вида, преимущественно вызы­вающих инфекции человека и животных. Совершенные формы относят к роду Arthroderma гимноасковых.

Около 60% всех выделенных от людей видов составляет Т. rubrum, около 25 % Т. mentagrophytes, около 10 % - Т. verruco-sum и Т. tonsurans. Все остальные виды: Е. fioccosum, M. andonini, М. canis и другие - вызывает 1 %-5 % всех дерматофитозов.

Дерматофитозы

Таблица 1

Патогенез дерматофитозов

Дерматофиты колонизируют кератиновые ткани и в ответ на их клетки и метаболиты возникает воспалительная реакция организма на уровне кожи. Поражения являются преимущественно кожными вследствие неспособности дерматофитов инвазировать глубокие ткани и органы. Лишь в редких случаях вовлекаются подкожные ткани (керион, гранулёма Майокки) или возникает генерализован­ная системная инфекция, вызванная дерматофитами.

In vitro дерматофиты повреждают кератин сочетанием фермен­тативного переваривания протеиназами (кератиназами) и механи­ческого давления.

In vivo их активность проявляется в зоне дифференциации на вновь синтезированном кератине. В течение инкубационного пе­риода гифы прорастают в stratum corneum кожи и затем в волося­ной фолликул и в стержень волоса, поражая новые фолликулы.

Для поддержания инфекции рост гриба координируется со скоро­стью продукции кератина. Инфекционный процесс останавливает­ся и излечение начинается, когда вновь синтезирующийся здоро­вый кератин удаляет гифы гриба из кератинизированной зоны.

Виды рода Trichoplyton поражают кожу, волосы и ногти.

Виды рода Microsporum поражают волосы, кожу и очень редко ногти.

Виды Epidermophyton поражают кожу и ногти, но не волосы.

Предрасполагают к инфекции: наследственные факторы, на­рушения микроциркуляции, повышенная температура, влажность.

Заболевания начинаются с локального воспаления в месте пер­вичного внедрения гриба. Воспалительные изменения наиболее выражены на периферической границе очагов.

Клинические проявления заболеваний классифицируются в за­висимости от анатомической локализации.

Ниже мы приводим таблицу (Табл. 2).

Таблица 2

Лабораторная диагностика

Диагноз дерматомикозов ставят на основании клинической картины и результатов лабораторных исследований.

Лабораторные исследования состоят из следующих этапов:

I. Взятие и транспортировка патологического материала; 

II. Микроскопия материала;

III. Выделение и идентификация чистой культуры возбудителя с определением чувствительности к химиопрепаратам;

IV. Серологические и аллергологические исследования.

I. Взятие и транспортировка патологического материала.

Правильное взятие материала в значительной степени влияет на успех микроскопии и получение культуры, так как не все че­шуйки и волосы из очагов поражения содержат элементы гриба. Патологический материал следует брать в максимально возмож­ном количестве из очагов, не подвергавшихся местному лечению.

Кожные чешуйки соскабливают с активных периферических краев очага поражения или в межпальцевых промежутках с помо­щью стерильного, слегка затупленного скальпеля. Обрывки мацерированного, белесоватого рогового слоя и покрышки пузырьков берут пинцетом. Поверхностные корочки и чешуйки в центре микотических очагов содержат значительно меньше грибных элемен­тов и менее пригодны для исследования. Дня взятия материала с шелушащихся очагов на гладкой коже и у детей можно применять прозрачную липкую ленту.

Глубокие слои пораженной ногтевой пластинки соскабливают скальпелем, извлекая рыхлые роговые массы. Для взятия мате­риала из пораженных ногтей используют маникюрные ножницы, скальпели, пинцет, препаровальные иглы. Получение тонко раз­мельченного патологического материала облегчает дальнейшие исследования.

При поражении волос эпиляционным пинцетом извлекают рас­положенные на периферии очага деформированные, белесоватые, обломанные волосы, изменившие цвет и потерявшие эластичность.

Исследование лампой Вуда

Лампа Вуда является инструментом, облегчающим диагности­ку и взятие исследуемого материала при клинически выраженных и субклинических формах грибковых инфекций, а также использу­ется для контроля излеченности. Лампа Вуда - это ультрафиолето­вая лампа со стеклянным фильтром, состоящим из силиката бария с 9 % окисью никеля и пропускающим длинноволновые УФ-лучи 365 нм, используется для облучения в темноте с расстояния до по­верхности 20 см. Лампа Вуда вызывает флюоресценцию, индуци­руемую у некоторых микроорганизмов.

Ярко-зеленая флюоресценция наблюдается при поражении волос дерматофитами рода Microsporum (M. audouinii, M. canis, М. ferrugenium, Mdistortum). Метод позволяет быстро и легко про­вести скриннинг значительных контингентов людей (детей) при по­дозрении на микроспорию. Ограничивает применение лампы Вуда увеличение этиологической роли Т. tonsurans (слабая флюоресцен­ция) и других нефлюоресцирующих видов дерматофитов.

При разноцветном лишае (М. furfur) пораженная кожа имеет золотисто-желтую флюоресценцию, при эритразме (возбудитель -Corynebacterium minutissimum) - красную, при поражении ран бак­териями рода Pseudomonas - ярко-зеленую. Артефакты при иссле­довании могут быть обусловлены использованием некоторых кос­метических и антифунгальных мазей.

Для взятия материала при стертых формах микозов волосистой части головы можно использовать стерильный вельвет, ковровый лоскут, стерильную щетку для мытья рук с нанизанным на ее ворс на глубину 0,3-0,5 мм бинтом, создающим при вычесывании волос фильтроподобный слой, на котором задерживаются чешуйки и во­лосы. Для посева бинт расстилают на питательной среде до появ­ления роста гриба.

Патологический материал можно собирчть в стерильные чашки Петри; между двумя стерильными предметными стеклами, скреп­ленными резинками и завернутыми в бумагу; в пакеты из черной бумаги, чтобы лучше видеть чешуйки и волоски. Следует избегать использования пергаментной и вощеной бумаги, так как при раз­ворачивании может произойти потеря и распространение патоген­ного материала.

Транспортировка и пересылка материала производятся в сте­рильных биксах с сопроводительными документами. В сопроводи­тельной бумаге следует указывать:

1) ФИО, возраст, пол больного;

2) учреждение и ФИО врача;

3) дату взятия и характер материала;

4) предполагаемый диагноз и № истории болезни.

Для взятия и исследования материала желательно иметь сле­дующее оборудование: микроскоп световой, фазовоконтрастное устройство, осветитель, окулярный микрометр, микологические лопатки, бактериологические петли, препаровальные иглы, скаль­пели, пинцеты эпиляционные, пинцеты хирургические и анатоми­ческие, ножницы, шпатели, газовые горелки или спиртовки, чашки Петри, предметные и покровные стекла, пробирки бактериологи­ческие, пробирки центрифужные, предметные стекла с лунками, колбы, воронки, пипетки мерные, глазные, пастеровские, палочки стеклянные, карандаши по стеклу, лупу.

Работа в микологической лаборатории, связанная с исследовани­ем инфекционного материала, должна проводиться в соответствии с существующими инструкциями по технике безопасности и противо­эпидемическому режиму. В лаборатории следует иметь шкафы для чистой посуды, инструментов, питательных сред, реактивов. Для де­зинфекции рабочих столов, стекол с патологическим материалом, защитных клеенок используют 5 % раствор хлорамина, раствор лизо­ла и другие средства, указанные в Инструкции МЗ СССР № 985-72 по проведению противоэпидемических и дезинфекционных меро­приятий при микроспории, трихофитии и фавусе. Инструменты и посуду после использования при взятии материала подвергают обез­зараживанию и тщательной механической очистке. Культуры грибов и патологический материал автоклавируют 30 мин при 120° или ки­пятят в течение часа. Рабочие столы и воздух в лаборатории стерили­зуют УФ лучами ртутно-кварцевой лампы.

Патологический материал исследуют в кратчайший срок после его взятия. Для этого его следует разделить на 3 части:

- для микроскопии;

- для получения культур;

- для повторного контрольного исследования.

II. Микроскопия патологического материала - наиболее про­стой и быстрый метод для установления наличия гриба в тканях. Для этого кожные и ногтевые чешуйки размельчают препароваль­ными иглами, а длинные волосы (при фавусе) делят на короткие фрагменты (0,1-1 мм) ребром нагретого скальпеля или прокален­ной препаровальной иглой. Размельченный материал помещают на середину предметного стекла, наносят 1—2 капли 10 % КОН и слег­ка подогревают над пламенем до появления белесоватого ободка по краю капли, не доводя до кипения, накрывают покровным стек­лом и оставляют на 5-10 мин (волосы, кожные чешуйки), 30-40 мин (ногтевые чешуйки) для мацерации и просветления.

При перегревании препарата, сильном надавливании или слишком длительной обработке происходят деформация волос и нарушение расположения спор и мицелия гриба. Чтобы обойтись без нагревания, препарат выдерживают в 20% КОН 30-60 мин. Препараты микроскопируют вначале под малым увеличением с опущенным конденсором или с прикрытой апертурной диафраг­мой для затемнения поля зрения; затем избранные места просмат­ривают при большом увеличении сухой системы с приподнятым конденсором. При незначительном количестве элементов гриба (в начале болезни) или при их нечеткости рекомендуется пользовать­ся фазово-контрастным устройством.

Кроме КОН, существует целый ряд растворов, применяющихся для просветления кератина роговых чешуек и волос: лактофенол (20 г 85 % молочной кислоты, 40 г глицерина, 20 мл дистиллиро­ванной воды, 20 г кристаллической карболовой кислоты и 0,05 г хлопчатобумажной синьки), хлорлактофенол (20 г кристалличе­ского хлоралгидрата, 10 г кристаллической карболовой кислоты, 10 г молочной кислоты), 10 % водно-спиртовый раствор сульфида натрия, 15 % КОН в 15 % диметилсульфоксиде на дистиллирован­ной воде. Оптимальными и приблизительно равноценными рас­творами, просветляющими кожные и ногтевые чешуйки, являются 10 % КОН, 15 % КОН+15 % ДМСО и 10 % Na2S.

Для обработки грубых роговых масс ногтей, чешуек кожи с подошв и ладоней и при массовых осмотрах применяют методы обогащения. Материал в центрифужных пробирках заливают 1,5-2 мл 20 % КОН, кипятят в водяной бане 30-60 мин, затем центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин или отстаивают 1 сутки. После сливания жидкости осадок переносят на предметное стекло пасте­ровской пипеткой и микроскопируют.

Ногтевые чешуйки рекомендуется обрабатывать PAS (periodic acid-Shiff) методом, который окрашивает гифы грибов в красный цвет.

Характер поражения волос дерматофитами позволяет опреде­лить родовую принадлежность гриба. Вид можно определите только по культуре.

Существуют следующие типы поражения волос дерматофитами: 

I. Trichophyton ectotrix - артроспоры располагаются непра­вильными цепочками снаружи волоса, окружая его в основании. Пораженные волосы не флюоресцируют. Tr. ectotrix имеет две разновидности: Тг. ectotrix megasporon (крупноспоровый, размер спор 8-12 мк), характерен для поражения Т. equinum, T. gallinae, Т. megninii, Т. rubrum, Т. verrucosum и Tr. ectotrix microides (мел­коспоровый, размер спор 3—5 мк), характерен для поражения Т. mentagrophytes.

2. Trichophyton endotrix - артроспоры размером 3-5 мк парал­лельными цепочками располагаются только внутри волоса. Пора­женные волосы не флюоресцируют: они скручиваются и ломают­ся, оставляя короткие пеньки или «черные точки». Данный тип по­ражения характерен для Т. tonsurans, T. violaceum, а также для аф­риканских дерматофитов Т. gourvilii, T. soudanense, T. yaoundei.

3. Microsporum - артроспоры размером 2-3 мк (нечетко видны при малом увеличении) беспорядочно-мозаично располагаются внутри волоса и белесоватым чехлом окружают его стержень сна­ружи. Пораженные волосы ярко флюоресцируют; обламываясь, они оставляют пеньки 5-8 мм. Такой тип поражения волос харак­терен для М. audouinii, M. canis, M. distortum, M. ferrugineum. При надавливании на покровное стекло в препарате из пораженного микроспорумами волоса иногда можно видеть мицелиальную ба­хромку - так называемую «кисть Адамсона». Волосы, пораженные М. gypseum, M. fulvum, M. nanum, M. vanbreuseghemii, не флюо­ресцируют, споры при этом более крупные (5-8 мк) и видны при малом увеличении.

4. Trichophyton - характерное для фавуса полиморфное пора­жение волос септированными гифами мицелия разной ширины и артроспорами различной величины, расположенными внутри во­лос, содержащих пузырьки воздуха и капельки жира. Волосы не заполнены грибковыми элементами, остаются длинными; слабо флюоресцируют под лампой Вуда. Однако не следует основывать диагноз только на наличии в волосе пузырьков воздуха и капель жира, так как они иногда наблюдаются и при других типах пора­жения. Кроме поражения волос по типу Achorion, для фавуса ха­рактерно образование скутул,- желтых корочек, содержащих гифы и споры гриба. Данный тип поражения вызывают Т. schoenleinii, Т. violaceum, M. gypseum.

В чешуйках гладкой кожи, пораженной дерматофитами, можно видеть гифы септированного ветвистого мицелия шириной 2-4 мк, иногда цепочки из округлых или многоугольных артроспор разме­ром 4-7 мк. В ногтевых чешуйках чаще наблюдают цепочки или скопления артроспор и реже гифы мицелия.

Следует отличать от элементов гриба такие артефакты, возни­кающие в препаратах, как так называемый «мозаичный гриб» (рас­полагается по границам эпителиальных клеток, состоит из фрагмен­тов органической природы различного размера), удлиненные кри­сталлы щелочи (полигональная форма); исчезают при промывании препарата, для чего с одной стороны наносят каплю воды, а с дру­гой помещают кусочек фильтровальной бумаги и осторожно, чтобы не потерять материал, повторяют 2-3 раза, капли жира (различные размеры, отсутствие внутренней структуры), нити ваты (размер, го­могенность, неправильная форма, кисточка на конце).

В заключении по микроскопии патологического материала ука­зывают тип поражения волос, наличие или отсутствие мицелия и спор гриба в кожных и ногтевых чешуйках. Однако считают, что гифы дерматофитов в препаратах неотличимы от мицелия дрож-жеподобных или плесневых грибов. Поэтому для определения ви­да возбудителя нужно сочетать микроскопию патологического ма­териала с получением чистой культуры. При этом образцы патоло­гического материала следует культивировать и при отрицательных результатах микроскопии.

III. Культуральное исследование

Оно необходимо для выделения и идентификации возбудителя, для определения латентного дерматофитоза, носительства дерма-тофитов здоровыми лицами, выявления дерматофитов в окру­жающей среде и определения чувствительности культуры к химиопрепаратам

3.1. Получение чистой культуры.

Исследуемый материал следует максимально измельчить и засе­вать в минимальных количествах на скошенный агар в пробирках в 2-4 точки на расстоянии 1-2 см. Материалом одной пробы засевают не менее 2-3 пробирок (волосы) и 4-5 пробирок (кожные и ногтевые чешуйки) на две различные питательные среды. Для первичной изо­ляции дерматофитов предпочтительно использовать стандартную агаршованную среду Сабуро (SDA); 2 или 4 % глюкозы (глюкоза 20 или 40 г, пептон 10 г, агар 20 г, дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,0), сусло-агар (пивное сусло, разбавленное дистиллирован­ной водой до 7 % углеводов по Баллингу, агар 20 г) или среду Сабуро с антибиотиками: антибактериальные антибиотики (пенициллин: 50 мкг/мл+стрептомицин 50-100 мкг/мл или левомицетин 50 мкг/мл, или биомицин 200 ед/мл, гентамицин) и антиплесневой антибиотик актидион (циклогексимид) 0,1-0,4 мг/мл. Приготовление селектив­ных сред с антибиотиками - 200 000 ед кристаллического пеницил­лина растворяют в 10 мл стерильной воды, 1 мл этого раствора + 9 мл воды дают концентрацию 2000 мкг/мл. Добавление 2,5 мл этого раз­ведения к 100 мл растопленной и охлажденной до 50° среды дает концентрацию пенициллина 50 мкг/мл. Аналогично производят до­бавление в среду стрептомицина (1 г стрептомицина=1 млн.ед). Био­мицин добавляют растворением 1 таблетки (100000 ед) в 500 мл ос­тывающей среды. Левомицетин предварительно растворяют в 10 мл 70° этилового спирта и добавляют в среду до концентрации 50 мкг/мл. Актидион (антибиотик из Streptomyces griseus) - белый кристаллический порошок, термостабильный, хорошо растворимый в ацетоне. В 1 мл ацетона растворяют 10-50 мг актидиона, доводят до 2 мл дистиллированной водой и прибавляют к 100 мл остывающей среды. Актидион не влияет на рост дерматофитов и подавляет многие плесневые грибы, а также виды Candida и Cryptococcus. Поэтому при подозрении на этилогическую роль этих грибов посевы следует про­изводить также и на среды без актидиона.

Посевы инкубируют в термостате при 25-30-37° соответственно (чаще 30°) и исследуют еженедельно до 4 недель. При подозрении на Т. verrucosum половину засеянных пробирок следует инкубиро­вать при 37°, так как гриб быстрее растет при этой температуре. Первые признаки роста дерматофитов отмечают с 4 по 12 день ин­кубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования счи­тают отрицательными. В оптимальных условиях первичные культу­ры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7-10 день после посева, но в случае фавиформных грибов иногда только на 20-30 день. Первичные культуры растут сравнительно медленно и при использовании сред без антибиотиков могут быть подавлены более быстро растущими бактериями и плесневыми грибами. В от­личие от последних, колонии дерматофитов никогда не бывают черными, голубыми или зелеными. Важно соблюдать асептику при взятии и хранении материала, а также исследовать его в кратчай­ший срок. При появлении роста желательно произвести отсев с края первичной культур