Основные свойства транскрипционных факторов суперсемейства FUR

Введение

Цианобактерии, представляющие главный источник фотосинтетической продукции в биосфере, нуждаются в ионах железа в качестве кофакторов фотосинтетической и дыхательной электрон-транспортных цепей, а также многих других клеточных функций. В связи с этим изучение генетической регуляции систем транспорта и гомеостаза железа у фотосинтезирующих организмов имеет большое фундаментальное и практическое значение. Широко известным модельным объектом молекулярной генетики фотосинтезирующих организмов является одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis 6803). Благодаря современным подходам биоинформатики и активному применению ДНК-микроэррей анализа, у Synechocystis 6803 выявлены гены предполагаемых систем транспорта железа (Katoh et al., 2001), в том числе гены, индуцируемые недостатком железа в среде (Houot et al., 2007). Однако функции многих из них не идентифицированы и их регуляция остается мало изученной. Известным глобальным регулятором гомеостаза железа у бактерий является ген fur, гомолог которого присутствует и у цианобактерий. Однако у цианобактерий этот ген является жизненно важным, вследствие чего выяснить его функцию с помощью инактивации до сих пор не удавалось. В нашей лаборатории сконструированы условные мутанты с инактивированным геном fur, которыев настоящее время служат объектом активных исследований. Вместе с тем важным является вопрос о регуляции самого гена fur, в чем может участвовать недавно обнаруженная антисмысловая РНК asFur.

Цель работы заключалась в изучении роли гена fur и гена его антисмысловой РНК в регуляции генов транспорта железа у цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803. В связи с этим были поставлены следующие задачи.

1. Сконструировать мутанты Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur для анализа функции этого гена.

2. Охарактеризовать мутант Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur.

3. Изучить характер экспрессии ряда генов предполагаемого fur -регулона у мутантов с регулируемым геном fur  и у мутантов с дополнительной регулируемой копией гена asFur.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Роль гена fur в гомеостазе железа и регуляции стрессового ответа у бактерий

Металлы служат необходимыми для клетки макро- и микроэлементами. К макроэлементам относятся натрий, калий, магний и кальций, к микроэлементам – часть переходных металлов, среди которых наиболее распространены железо, цинк, медь и марганец и реже встречаются кобальт, никель, молибден, хром и ванадий (Rosakis, 2004). Потребность в металлах широко варьирует у разных бактерий, однако их внутриклеточная концентрация строго контролируется на определенном уровне, поскольку как их недостаток (голодание), так и избыток (токсичный эффект) вреден для клетки. Железо, наряду с цинком и магнием, необходимо для всех микроорганизмов, за исключением некоторых молочнокислых бактерий и спирохет рода Borrelia (Posey, Gherardini, 2000). В основном железо присутствует в белках, содержащих гем и железосерные кластеры; при этом железосодержащие белки выполняют функции переносчиков электронов, катализаторов ферментативных реакций, а также регуляторов экспрессии генов, выступая в роли сенсоров внешних и внутренних условий клетки (Lill, 2009).

Многие микроэлементы, играющие важную роль в метаболизме бактерий, труднодоступны в природе. Например, недостаток железа является ограничивающим фактором первичной продуктивности океана (Coale et al., 1996), а его доступность в организме-хозяине (растении или животном) служит определяющим условием размножения патогенных бактерий (Nairz et al., 2010). Для выживания в условиях недостатка железа клетки развили ряд ответов, таких как уменьшение размера, сокращение числа вторичных метаболитов, синтез альтернативных белков (замещающих железосодержащие) и включение разнообразных механизмов эффективного поглощения железа из окружающей среды. Такие стратегии гомеостаза предполагают тонкую настройку экспрессии генов для физиологической адаптации клеток к изменяющейся концентрации металлов и предотвращения синтеза токсичных метаболитов. Железо, например, катализирует в реакции Фентона образование наиболее реакционноспособной и токсичной для клетки активной формы кислорода (АФК), гидроксильного радикала (Imlay, 2003). Физиолого-биохимические и генетические исследования доказывают прямую связь развития окислительного стресса с увеличением пула свободного внутриклеточного железа, как ординарным, так и вследствие нарушения гомеостаза этого металла (Touati, 2000; Latifi et al., 2005; Cornelis et al., 2011). В связи с этим у аэробных организмов имеет место координация гомеостаза железа и адаптивного ответа на окислительный стресс, и данную функцию у многих бактерий выполняет ген fur (ferric uptake regulator). То же название имеет суперсемейство родственных регуляторных белков, транскрипционных факторов, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов гомеостаза металлов и стрессового ответа клетки (Табл. 1).

Таблица 1.

Типичные представители регуляторных белков суперсемейства FUR*

Белок	Основной адаптивный ответ	Металл-кофактор	Структурный металл
Fur	Гомеостаз металла	Fe2+	Zn2+
Zur		Zn2+	Zn2+
Nur		Ni2+	Zn2+
Mur		Mn2+	–
PerR	Окислительный стресс	Fe2+	Zn2+
Irr	Усвоение гема	Fe2+/гем	–

*Использованы данные из работы (Fillat, 2014)

Введение

Цианобактерии, представляющие главный источник фотосинтетической продукции в биосфере, нуждаются в ионах железа в качестве кофакторов фотосинтетической и дыхательной электрон-транспортных цепей, а также многих других клеточных функций. В связи с этим изучение генетической регуляции систем транспорта и гомеостаза железа у фотосинтезирующих организмов имеет большое фундаментальное и практическое значение. Широко известным модельным объектом молекулярной генетики фотосинтезирующих организмов является одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis 6803). Благодаря современным подходам биоинформатики и активному применению ДНК-микроэррей анализа, у Synechocystis 6803 выявлены гены предполагаемых систем транспорта железа (Katoh et al., 2001), в том числе гены, индуцируемые недостатком железа в среде (Houot et al., 2007). Однако функции многих из них не идентифицированы и их регуляция остается мало изученной. Известным глобальным регулятором гомеостаза железа у бактерий является ген fur, гомолог которого присутствует и у цианобактерий. Однако у цианобактерий этот ген является жизненно важным, вследствие чего выяснить его функцию с помощью инактивации до сих пор не удавалось. В нашей лаборатории сконструированы условные мутанты с инактивированным геном fur, которыев настоящее время служат объектом активных исследований. Вместе с тем важным является вопрос о регуляции самого гена fur, в чем может участвовать недавно обнаруженная антисмысловая РНК asFur.

Цель работы заключалась в изучении роли гена fur и гена его антисмысловой РНК в регуляции генов транспорта железа у цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803. В связи с этим были поставлены следующие задачи.

1. Сконструировать мутанты Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur для анализа функции этого гена.

2. Охарактеризовать мутант Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur.

3. Изучить характер экспрессии ряда генов предполагаемого fur -регулона у мутантов с регулируемым геном fur  и у мутантов с дополнительной регулируемой копией гена asFur.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Роль гена fur в гомеостазе железа и регуляции стрессового ответа у бактерий

Металлы служат необходимыми для клетки макро- и микроэлементами. К макроэлементам относятся натрий, калий, магний и кальций, к микроэлементам – часть переходных металлов, среди которых наиболее распространены железо, цинк, медь и марганец и реже встречаются кобальт, никель, молибден, хром и ванадий (Rosakis, 2004). Потребность в металлах широко варьирует у разных бактерий, однако их внутриклеточная концентрация строго контролируется на определенном уровне, поскольку как их недостаток (голодание), так и избыток (токсичный эффект) вреден для клетки. Железо, наряду с цинком и магнием, необходимо для всех микроорганизмов, за исключением некоторых молочнокислых бактерий и спирохет рода Borrelia (Posey, Gherardini, 2000). В основном железо присутствует в белках, содержащих гем и железосерные кластеры; при этом железосодержащие белки выполняют функции переносчиков электронов, катализаторов ферментативных реакций, а также регуляторов экспрессии генов, выступая в роли сенсоров внешних и внутренних условий клетки (Lill, 2009).

Многие микроэлементы, играющие важную роль в метаболизме бактерий, труднодоступны в природе. Например, недостаток железа является ограничивающим фактором первичной продуктивности океана (Coale et al., 1996), а его доступность в организме-хозяине (растении или животном) служит определяющим условием размножения патогенных бактерий (Nairz et al., 2010). Для выживания в условиях недостатка железа клетки развили ряд ответов, таких как уменьшение размера, сокращение числа вторичных метаболитов, синтез альтернативных белков (замещающих железосодержащие) и включение разнообразных механизмов эффективного поглощения железа из окружающей среды. Такие стратегии гомеостаза предполагают тонкую настройку экспрессии генов для физиологической адаптации клеток к изменяющейся концентрации металлов и предотвращения синтеза токсичных метаболитов. Железо, например, катализирует в реакции Фентона образование наиболее реакционноспособной и токсичной для клетки активной формы кислорода (АФК), гидроксильного радикала (Imlay, 2003). Физиолого-биохимические и генетические исследования доказывают прямую связь развития окислительного стресса с увеличением пула свободного внутриклеточного железа, как ординарным, так и вследствие нарушения гомеостаза этого металла (Touati, 2000; Latifi et al., 2005; Cornelis et al., 2011). В связи с этим у аэробных организмов имеет место координация гомеостаза железа и адаптивного ответа на окислительный стресс, и данную функцию у многих бактерий выполняет ген fur (ferric uptake regulator). То же название имеет суперсемейство родственных регуляторных белков, транскрипционных факторов, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов гомеостаза металлов и стрессового ответа клетки (Табл. 1).

Таблица 1.

Типичные представители регуляторных белков суперсемейства FUR*

Белок	Основной адаптивный ответ	Металл-кофактор	Структурный металл
Fur	Гомеостаз металла	Fe2+	Zn2+
Zur		Zn2+	Zn2+
Nur		Ni2+	Zn2+
Mur		Mn2+	–
PerR	Окислительный стресс	Fe2+	Zn2+
Irr	Усвоение гема	Fe2+/гем	–

*Использованы данные из работы (Fillat, 2014)

Основные свойства транскрипционных факторов суперсемейства FUR

Белки суперсемейства FUR широко распространены у прокариот. В настоящее время известно около 10000 последовательностей, принадлежащих 4091 видам различных бактерий и архей (Fillat, 2014). Упрощенная модель наиболее распространенного механизма действия белка Fur заключается в специфическом связывании димера Fur в комплексе с металлом-кофактором в качестве корепрессора с палиндромными А/Т богатыми последовательностями, находящимися в промоторе контролируемых генов (Bagg, Neilands, 1987). Связывание кофактора вызывает конформационные изменения белка-регулятора, что способствует его стабильному взаимодействию с ДНК. Несмотря на структурные различия, белки суперсемейства имеют общие черты строения. На N-конце они содержат ДНК-связывающий домен, а на С-конце – регуляторный металл-связывающий участок, способный к димеризации (рис. 1; Pohl et al., 2003). Как правило, белки этого суперсемейства содержат богатую гистидиновыми остатками область HHHXHX₂CX₂C, расположенную в начале димеризационного домена – после шарнирной области между N-концевым ДНК-связывающим доменом и С-концом (http://pfam.xfam.org/family/PF01475). Менее консервативный мотив CXXC находится на С-конце некоторых ортологов белка Fur, а также у всех белков Zur и PerR, идентифицированных к настоящему времени.

Белки суперсемейства FUR обычно регулируют экспрессию собственного гена; однако, обнаружены и другие факторы, влияющие на уровень их внутриклеточной концентрации. Как правило, в клетке активно несколько белков данного семейства с различными функциями (Hantke, 2001; Fuangthong, Helmann, 2003; Botello-Morte et al., 2013), и в связи с этим часто образуются функционально значимые перекрывания регуляторных областей генов, кодирующих эти белки (Horsburgh et al., 2001; Fuangthong et al., 2002; Hernandez et al., 2004; Hohle, O’Brian, 2010).

Наиболее активно исследуемыми и хорошо изученными представителями описываемого суперсемейства являются белки Fur (прототип семейства с огромным количеством ортологов), основная функция которых заключается в регуляции поглощения клеткой железа.