Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...
Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...
Топ:
Характеристика АТП и сварочно-жестяницкого участка: Транспорт в настоящее время является одной из важнейших отраслей народного хозяйства...
Основы обеспечения единства измерений: Обеспечение единства измерений - деятельность метрологических служб, направленная на достижение...
Комплексной системы оценки состояния охраны труда на производственном объекте (КСОТ-П): Цели и задачи Комплексной системы оценки состояния охраны труда и определению факторов рисков по охране труда...
Интересное:
Что нужно делать при лейкемии: Прежде всего, необходимо выяснить, не страдаете ли вы каким-либо душевным недугом...
Отражение на счетах бухгалтерского учета процесса приобретения: Процесс заготовления представляет систему экономических событий, включающих приобретение организацией у поставщиков сырья...
Наиболее распространенные виды рака: Раковая опухоль — это самостоятельное новообразование, которое может возникнуть и от повышенного давления...
Дисциплины:
2020-04-01 | 174 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
a/4b полиморфизм обусловлен разным количеством 27-нуклеотидных повторов в четвертом интроне гена eNOS [22]. В норме их бывает четыре (4b-аллель), а при мутации - пять (4a-аллель).
Для ПЦР анализируемого участка гена eNOS были выбраны следующие праймеры:
- 5'-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3'- 5'-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3'
циклов амплификации проводились в конечном объеме 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг геномной ДНК, 250 пкмоль каждого праймера, 10мМ Tris-HCI pH 8.4, 1.2 mM, MgCI2, 50 mM KCI, 0,2 mМ каждого dNTP и одну единицу Taq-полимеразы (см. Таблицу 1). ПЦР включала: 45 сек - денатурация при 92 С°, 45 сек - отжиг при 56 С° и 45 сек - синтез при 72 С° (см. Таблицу 2).
Для генотипирования eNOS, продукты ПЦР анализировались в 2% агарозном геле. При комбинации аллелей формируются три генотипа: 4a4a (393 п.н.); 4a4b(393 п.н, 420 п.н.); 4b4b (420 п.н.).
Электрофорез
Это метод разделения смеси веществ (белков, нуклеиновых кислот) на ее составляющие по массе в электрическом поле на носителе. В качестве носителя используют гель из агарозы. Концентрация агарозы в геле варьируется в зависимости от массы разделяемых фрагментов. В состав геля также входят вода и реакционный буфер. Расплав агарозы хранится в термостате при 60 градусах. Гель получается при заливке этого расплава на подложку, где он, при комнатной температуре, застывает В застывшем геле делаются лунки. Такой гель помещается в кювету между электродами. Сама кювета тоже заполнена буфером. Проба смешивается с краской и наносится в лунки геля. Затем в электрическом поле происходит разгонка пробы. Каждая фракция пробы с одинаковой массой формирует полосу. Эта полоса светится красным в ультрафиолете, за счет красителя. Определение массы этой фракции проводится относительно маркера. Маркер при разгонке в электрическом поле дает полосы с известной массой.
|
Параметры электрофореза: 120В, 70мА, 90 минут
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рисунок 2
a4b полиморфизм гена eNOS, электрофорез в 2% агарозе.
, 2, 3, 4, 5, 6, 8 - норма 4b/4b (420 п.н.)
- гетерозигота 4а/4b (420, 393 п. н.)
- мутация 4а/4а (393 п. н.)
Статистический анализ
Статистическая обработка данных проводилась с помощью теста Хи-квадрат, точного критерия Фишера и метода относительного риска (ОР). Различия между сравниваемыми группами считались статистически значительными для доверительного интервала (ДИ) 95% (p=0,05). Проверка равновесия распределения генотипов в исследованных выборках, включая и случаи множественных сравнений внутри выборок, с законом Харди-Вайнберга проводилась с помощью теста Хи-квадрат.
Результаты и обсуждение
Распределения частот встречаемости аллелей и генотипов eNOS 4a/4b в изученных группах детей, представлены в таблице I. Частоты встречаемости аллелей и генотипов в исследуемых выборках не отличались значимо от теоретически ожидаемых в соответствии с законом Харди-Вайнберга.
Таблица I. Частоты встречаемости аллелей и генотипов eNOS 4a/4b в исследуемых группах детей
мальчики | девочки | общее | ||||||||
Группа риска | Контрольная группа | Группа риска | Контрольная группа | Группа риска | Контрольная группа | |||||
4a/4b | 12 | 17,14% | 25 | 32,89% | 10 | 32,26% | 19 | 27,95% | 22 | 44 |
4a/4a | 1 | 1,43% | 3 | 3,95% | 2 | 6,45% | 5 | 7,35% | 3 | 8 |
4b/4b | 57 | 81,43% | 48 | 63,16% | 19 | 61,29 | 44 | 64,70% | 76 | 92 |
4a | 14 | 10% | 31 | 20,39% | 14 | 22,58% | 29 | 21,32% | 28 | 60 |
4b | 126 | 90% | 121 | 79,61% | 48 | 77,42% | 107 | 78,68% | 174 | 228 |
На первом этапе мы провели сравнительный анализ распределения частот генотипов eNOS 4a/4b между детьми группы риска и детьми контрольной группы. Мы не обнаружили статистически значимых отличий в распределении генотипов (Х2=3.697, р=0,157).
Затем мы провели сравнительный анализ распределения частот аллелей 4а и 4b в группе риска по сравнению с контрольной группой и также не нашли статистически значимых различий между нашими исследуемыми группами (Х2=3.458, р=0,063).
|
Затем мы провели сравнительный анализ распределений частот генотипов в исследуемых группах отдельно для мальчиков и отдельно для девочек. При этом мы объединили генотипы 4a/4a и 4a/4b в один класс, и сравнили частоты распределения генотипа 4b/4b и носителей 4а аллеля в виде 4a/4a или 4a/4b генотипов для корректного применения теста Хи-квадрат.
Сравнение распределений генотипов в группах мальчиков показало статистически значимые различия между мальчиками из группы риска и мальчиками из контрольной группы (Х2=5.152, р=0,023), которые выражались в том, что количество носителей 4а аллеля мальчиков контрольной группы было примерно в 2 раза больше, чем у мальчиков группы риска (ОР=1,98 для 95% ДИ 1,12 - 3,51). Также у мальчиков контрольной группы частота встречаемости аллеля 4а была примерно в 2 раза выше, чем у мальчиков группы риска (ОР=2,04 для 95% ДИ 1,13 - 3,67). Между девочками групп сравнения статистически значимых различий в частотах аллелей и генотипов обнаружено не было (Х2=0.010, р=0,918).
На последнем этапе мы провели статистический анализ распределения генотипов внутри группы риска в зависимости от типа наследственной отягощённости и встречаемости её в родословной семей обследуемых детей (таблицы II-IV).
Для начала мы сравнили распределения генотипов в группе риска в зависимости от количества у исследованных детей родственников с ожирением. Мы ранжировали детей групп риска на три класса. Класс (1-3) включал детей, имевших от 1 до 3х близких родственников с ожирением, класс (4-6)-соответственно 4-6 родственников с ожирением и класс (7-10) - от 7 до 10 родственников с ожирением (см. таблицу II).
сердечный полиморфизм ген наследственный дети
Таблица II. Частоты встречаемости генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ в зависимости от количества родственников с ожирением
Количество родственников с ожирением | Количество детей | 4a/4a+4a/4b | 4b/4b |
Класс (1-3) | 42 | 8 | 34 |
Класс (4-6) | 37 | 13 | 24 |
Класс (7-10) | 8 | 2 | 6 |
Сравнительный анализ между классами был проведен с использованием точного критерия Фишера и не выявил статистически значимых различий в распределениях генотипов между классами (р=0,653). То есть распределение генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ не зависит от встречаемости в родословной родственников с ожирением.
|
Затем мы сравнили распределения генотипов в группе риска в зависимости от того, имели ли близкие родственники СД2 или не имели (см. таблицу III).
Таблица III. Частоты встречаемости генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ в зависимости от наличия родственников с СД2
Наличие СД2 | Количество детей | 4a/4a + 4a/4b | 4b/4b |
Нет родственников с СД2 | 48 | 12 | 36 |
Есть родственники с СД2 | 37 | 12 | 25 |
Сравнительный анализ также был проведен с использованием точного критерия Фишера и не выявил статистически значимых различий в распределениях генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ в зависимости от наличия у них родственников с СД2 (р=0,476).
Наконец, мы сравнили распределения генотипов в группе риска в зависимости от количества у исследованных детей близких родственников с ССЗ. Мы ранжировали детей группы риска на 4 класса в зависимости от количества родственников с ССЗ: класс (1-3),класс (4-6), класс (7-9) и класс (10-17) (см. таблицу IV).
Таблица IV. Частоты встречаемости генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ в зависимости от количества родственников с ССЗ
Количество родственников с ССЗ | Количество детей | 4a/4a + 4a/4b | 4b/4b |
Класс (1-3) | 25 | 8 | 17 |
Класс (4-6) | 30 | 9 | 21 |
Класс (7-10) | 16 | 7 | 9 |
Класс (10-17) | 12 | 2 | 10 |
Затем мы методом точного критерия Фишера провели сравнение распределений генотипов между классами и также не обнаружили статистически значимых различий в зависимости от количества родственников с ССЗ. Группы были генетически однородны (р=0,223).
Таким образом, мы не обнаружили в исследованной выборке детей из группы риска различий в распределении генотипов и частот аллелей 4a/4b полиморфизма гена eNOS по сравнению с контрольной группой детей и в зависимости от типа отягощённой наследственности и её встречаемости в родословной детей. Присутствие аллеля 4а в генотипе детей из группы риска не было ассоциировано с присутствием конституциональных факторов риска развития ССЗ, а именно с отягощённой наследственностью по ожирению, СД2 и ССЗ. Более того, у мальчиков из группы риска количество носителей 4а аллеля было даже меньше, чем у мальчиков из контрольной группы. Наши результаты во многом согласуются с работами других авторов, которые также показывают отсутствие ассоциативных связей между 4a/4b полиморфизмом в гене eNOS и риском ССЗ. Однако существуют работы, которые обнаруживают ассоциативную связь полиморфизма гена eNOS с риском развития ССЗ, так как роль гена eNOS в системе эндотелиальной функции является ключевой. Поэтому в дальнейшем мы планируем изучить другие полиморфизмы в этом гене, в первую очередь С-786Т и Glu298Asp.
|
Выводы
) Сравнительный анализ распределения частот генотипов eNOS 4a/4b между детьми группы риска и детьми контрольной группы не выявил статистически значимых отличий в распределении генотипов
) Сравнительный анализ распределения частот аллелей 4а и 4b в группе риска по сравнению с контрольной группой также не выявил статистически значимых различий между нашими исследуемыми группами
) Сравнение распределений генотипов в группах мальчиков показало статистически значимые различия между мальчиками из группы риска и мальчиками из контрольной группы. Также у мальчиков контрольной группы частота встречаемости аллеля 4а была примерно в 2 раза выше, чем у мальчиков группы риска. Между девочками групп сравнения статистически значимых различий в частотах аллелей и генотипов обнаружено не было.
) Сравнение распределений генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ в зависимости от количества родственников с ожирением не выявило статистически значимых различий между нашими исследуемыми группами.
) Сравнение распределений генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ в зависимости от наличия родственников с СД2 не выявило статистически значимых различий между нашими исследуемыми группами.
) Сравнение распределений генотипов eNOS 4a/4b в группе детей с риском ССЗ в зависимости от количества родственников с ССЗ не выявило статистически значимых различий между нашими исследуемыми группами. Группы были генетически однородны.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. М.В. Шестакова Дисфункция эндотелия - причина или следствие метаболического синдрома 2001.
2. Манухина Е. Б., Александров А. А. Оксид азота, дисфункция эндотелия и новые возможности патогенетической терапии сердечно-сосудистых заболеваний 2001.
. Минушкина Л., Затейщиков Д., Сидоренко Б. Генетические аспекты регуляции эндотелиальной функции при артериальной гипертонии Кардиология. 2000, №3, С. 68-76
. Lowenstein C.J., Glatt C.E., Bredt D.S., Snyder S.H. Cloned and expressed macrophage nitric oxide synthase contasts with the brain enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. - P. 6711-6715.
. Miyahara K., Kawamoto T., Sase K., et al. Cloning and structural characterization of the human endothelial nitric-oxide-synthase gene. Eur J Biochem. 1994 Aug 1;223(3):719-26
. Cai H., Wilcken D.E., Wang X.L. The Glu298-->Asp (894G-->T) mutation at exon 7 of the endothelial nitric oxide synthase gene and coronary artery disease. J Mol Med. 1999 Jun;77(6):511-4.
|
. Tomasz J. Guzik,1 Edward Black., et al. Relationship Between the G894T Polymorphism (Glu 298 Asp Variant) in Endothelial Nitric Oxide Synthase and Nitric Oxide-Mediated Endothelial Function in Human Atherosclerosis
. Nakayama M., Yasue H., Yoshimura M. et al. T-786®C mutation in the 5’-flanking region of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm // Circulation. - 1999. - Vol. 99. - P. 2864-2870.
9. Ichihara S., Yamada Y., Fujimura T., et al. Association of a polymorphism of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with myocardial infarction in the Japanese population. Am J Cardiol. 1998 Jan 1;81(1):83-6.
10. Ignarro L.J. Biological actions and properties of endothelium-derived nitric oxide formed and released from artery and vein. Circ Res. 1989 Jul;65(1):1-21.
11. Poirier O., Mao C., Mallet C., et al. Polymorphisms of the endothelial nitric oxide synthase gene - no consistent association with myocardial infarction in the ECTIM study. Eur J Clin Invest. 1999 Apr;29(4):284-90.
12. Tsukada T., Yokoyama K., Arai T., et al. Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Apr 7;245(1):190-3.
. Wang H.U., Anderson D.J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 1997;18:383-396.
. Britten M.B., Schachinger V., Dimmeler S., et al. ecNOS-polymorphism is associated with coronary endothelial disfunction. Eur Heart J 1999;20(144):907.
. Hou L., Osei-Hyiaman D., Yu H., et al. Association of a 27-bp repeat polymorphism in ecNOS gene with ischemic stroke in Chinese patients. Neurology. 2001 Feb 27;56(4):490-6.
. Чистяков Д.А., Воронько О.Е., Савостьянов К.В. и др. Полиморфные маркеры генов эндотелиальной NO-синтазы и сосудистого рецептора ангиотензиногена II и предрасположенность к ишемической болезни сердца. Генетика. 1999
. Котовская Ю.В., Кобалаева Ж.Д., Сергеева Т.В. и др. Полиморфизм генов ренин-ангиотензиновой системы и гена эндотелиальной NO-синтазы и макрососудистые осложнения при сахарном диабете типа 2. Артериальная гипертензия. 2002. Т.8, *3. С.86-90.
. Nakagami H., Ikeda U., Maeda Y., et al. Coronary artery disease and endothelial nitric oxide synthase and angiotensin-converting enzyme gene polymorphisms. J Thromb Thrombolysis. 1999 Oct;8(3):191-5.
. Granath B., Taylor R.R., van Bockxmeer F.M., Mamotte C.D. Lack of evidence for association between endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and coronary artery disease in the Australian Caucasian population. J Cardiovasc Risk. 2001 Aug;8(4):235-41.
. Yahashi Y., Kario K., Shimada K., Matsuo M. The 27-bp repeat polymorphism in intron 4 of the endothelial cell nitric oxide synthase gene and ischemic stroke in a Japanese population. Blood Coagul Fibrinolysis. 1998 Jul;9(5):405-9.
. Zhao Qi, SU Shao-yong, CHEN Shu-feng., et al. Association study of the endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms with essential hypertension in northern Han Chinese 2006.
. Taniwaki H, Ishimura E, Matsumoto N, Emoto M, Inaba M, Nishizava Y Relations Between ACE Gene and ecNOSGene Polymorphisms and Resistive Index in Type 2 Diabetic Patients With Nephropathy //Diabets Care. 2001; 24: 1653-1660.
|
|
Семя – орган полового размножения и расселения растений: наружи у семян имеется плотный покров – кожура...
История развития пистолетов-пулеметов: Предпосылкой для возникновения пистолетов-пулеметов послужила давняя тенденция тяготения винтовок...
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...
Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!