Методика работы с оптическим стандартом мутности

Ход работы:

Стандарт мутности – количество млрд. микробов в 1 мл взвеси.

1. Приготовить микробную взвесь. В пробирку с чистой культурой, выросшей на скошенном агаре, добавить 5 мл физиологического раствора и смыть культуру с поверхности среды, вращая между ладонями. При работе с колониями на чашках Петри в пробирку с 5 мл изотонического раствора добавить 1 – 2 петли культуры. Аккуратно смыть и равномерно распределить, вращая пробирку между ладонями 10 минут.

2. Сравнить мутность полученной взвеси с мутностью оптического стандарта и определить количество микробных тел по номеру мутности.

 

Лабораторная работа № 4

Проведение поверхностного посева «сплошным газоном»

1. На питательный агар нанести 2 – 3 петли полученной взвеси

2. Шпателем Дригальского тщательно растереть взвесь по поверхности агара.

3. На посев «сплошным газоном» поместить диски с антибиотиками.

4. Промаркировать чашки Петри и поставить в термостат вверх дном.

 

Задание №2. Определить чувствительность к антибиотикам выделенных культур методом дисков, провести учет результатов.

Оснащение: Чашки с тестируемыми культурами, линейки, дезинфицирующие средства.

Ход работы:

1. Рассмотрите флаконы с дисками, напишите в тетради перечень препаратов.

2. Возьмите в руки чашку с культурой дном вверх.

3. Определите наличие зоны задержки роста микробов вокруг дисков с разными антибиотиками.

4. Определите размер зоны с помощью линейки (измеряется диаметр зоны вместе с диском) и определите степень чувствительности микроорганизма к антибиотику:

Зона более 10 мм – чувствительный (S usceptible)

Зона менее 10 мм – малочувствительный (I ntermediate)

Зона отсутствует – устойчивый (R esistant)

5. Отметьте в строке над списком антибиотиков № чашки, которую вы оцениваете.

6. Напротив названия препарата поставьте обозначение S, I,  или R, в зависимости от наличия и размера зоны задержки роста.

7. Оцените подобным образом 4-5 чашек.

 

Лабораторная работа № 5

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 Микробиологический метод - Изучение живых или убитых микроорганизмов в окрашенном или неокрашенном виде с помощью микроскопа. Достоинства метода: быстрое исследование. Но так как микробы похожи друг на друга, он является ориентировочным.

2 Бактериологический метод – Выращивание микроорганизмов на питательных средах. При этом выделяют чистую культуру и изучают ее свойства. С этой целью исследуемый материал засевают на плотные или жидкие питательные среды и идентифицируют микроб, устанавливают его свойства.

3 Серологический метод – поиск специфических антител в сыворотке больного.

4 Биологический (экспериментальный) метод – материал от больного вводят в лабораторных животных (мыши, морские свинки). В их органах и тканях как в питательных средах происходит размножение микробов (возбудители столбняка, ботулизма).

5 Метод аллергических проб – путем этого метода выявляется сенсибилизация - повышенная чувствительность организма к микробным антигенам. Аллерген вводится внутрикожно. При положительной реакции появляется припухлость, покраснение.

Лабораторная работа № 6

ВЗЯТИЕ ПРОБ НА АНАЛИЗ И ДОСТАВКА ИХ В ЛАБОРАТОРИЮ.

Общие правила.

1 Пробы берутся чисто вымытыми руками, в перчатках.

2 Пробы для выделения культуры микроба помещают в стерильную посуду.

3 Пробы для серологических реакций (определение антител в сыворотке больного) помещаются в нестерильную посуду.

4 Проба доставляется в лабораторию в течение одного – двух часов после взятия материала, кроме проб на менингит, которые доставляются немедленно.

Забор материала:

1 Взятие крови на стерильность производится из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и непосредственно у постели больного засевается в 10 – кратное количество сахарного бульона.

2 Взятие гноя из открытого очага производится для выделения культуры микроба и определения чувствительности к антибиотикам. Пробы берутся стерильным ватным тампоном из глубоких слоев раны. Верхний слой гноя предварительно удаляется стерильным марлевым шариком.

3 Взятие гноя из закрытого очага производится стерильным шприцем. Место укола протирается спиртом. В шприц набирают 2 – 3 мм гноя и выливают в сухую стерильную пробирку.

4 Мазки из зева и носа на носительство патогенных кокков берутся у всех работников родильных домов и грудничковых групп больниц. Мазки берутся раздельно из зева и носа стерильными ватными тампонами и помещаются или в сухие стерильные пробирки, или в солевой бульон.

5 Посев на стерильность шовного и перевязочного материала производится в баклаборатории. Пробы помещаются в стерильные широкогорлые флаконы или колбы.

6 Анализ на дифтерию. Мазок берется раздельно из носа и зева стерильным ватным тампоном и помещается в сухие стерильные пробирки.

7 Анализ на дизентерию. Пробы берутся стерильным ватным тампоном непосредственно из прямой кишки или из освобожденного от хлора судна. Пробы помещаются в консервирующую смесь или непосредственно у постели больного засеваются на среду Плоскирева.

8 Анализы на брюшной тиф.

· Взятие крови на гемокультуру производится из локтевой вены 5 – 10 мл и непосредственно у постели больного засевается в 10 – кратное количество желчного бульона;

· Кровь на реакцию Видаля берется в течение всего заболевания из локтевой вены в количестве 2 – 3 мл и помещается в сухую не стерильную пробирку;

· Кал на выделение культуры микроба берется стерильным тампоном непосредственно из прямой кишки или из судна, горшка, освобожденных от хлора. Проба помещается в сухую, стерильную пробирку или в консервирующую смесь, состоящую из глицерина или физиологического раствора.

Освобождение судна от хлора. Судно промывается под струей горячей воды, затем струей холодной воды. Дают воде стечь. На дно стелют стерильную салфетку и дают больному.

9 Проба на холеру. У больных берется 50 – 70 грамм (2 - 3 столовые ложки) испражнений или рвотных масс. Выливаются в широкогорлые флаконы, которые закрываются корковыми или резиновыми пробками. Помещаются в металлические барабаны и специальным транспортом направляются в лабораторию.

10 Взятие крови на реакцию Вассермана. Кровь берется у всех беременных, назначенных на операцию, стерильно из локтевой вен в количестве 8 – 10 мл и помещается в сухую, чистую, стерильную пробирку, очень медленно.

 

Лабораторно – практическое занятие № 4

Протокол № 4

Тема: Изучение принципов иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней 

Цель: Получить представление о методах иммунологических исследований.

Задачи:

1. Ознакомиться с механизмами реакций агглютинации, преципитации, связывания комплемента.

2. Ознакомиться с наиболее распространенными вакцинами и сыворотками.

Практическая работа:

Лабораторная работа № 1

Изучение иммунохимических реакций

Комплекс «антиген – антитело» образуется при взаимодействии чужеродных для нашего организма веществ с защитными белками сыворотки крови (антителами). Поэтому такие реакции называют также серологическими (serum – сыворотка).

    Существуют два вида постановки иммунохимических реакций, используемых в диагностике:

1. Для выявления количества или титра антител в сыворотке крови с помощью известного антигена (серодиагностика). В качестве стандартного антигена применяется диагностикум.

2. Для обнаружения и идентификации антигенов в биологических жидкостях при помощи известных антител (серотипирование). В качестве препарата, содержащего антитела используются диагностические сыворотки.

Общие закономерности иммунологических методов:

· исследование проводится  in vitro;

· проявляется при иммунологическом соответствии (гомологичности) антигена и антитела;

· протекают в две фазы (невидимая и видимая).

Для количественной характеристики иммунологических методов исследования используют такие понятия, как чувствительность и специфичность.

 

Чувствительность = число положительных реакций у истинных больных * 100%

                         Число обследованных больных с подтвержденным диагнозом

 

Специфичность = число отрицательных реакций в контрольной группе * 100%

                         Число обследованных в контрольной группе

        

Все иммунологические методы можно разделить на три группы:

1). Основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.)

2). Основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой агглютинации, коагглютинации, латекс – агглютинации, угольной агломерации, связывания комплемента и др.)

3). С использованием меченых антител или антигенов (флюоресцирующих антител, иммуноферментного, радиоиммунного анализа и других методов).

II. Агглютинационные тесты.

    Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:

1. специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом – активным центром иммуноглобулина (невидимая фаза).

2. неспецифическая (видимая фаза) – образующийся комплекс (АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде – 0,85% раствора натрия хлорида.

Реакцию агглютинации можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови или при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифицировать выделенные микроорганизмы.

    Развернутая реакция агглютинации для выявления специфических антител в сыворотке крови больного ставится в пробирках или лунках полистироловых планшетов. У больного (до приема пищи) берется кровь из вены в чистую пробирку, и выдерживается комнатной температуре около часа. Стеклянной палочкой образовавшийся сгусток крови отделяется от желтоватой жидкости – сыворотки, которую отсасывают в стерильную пробирку и хранят при температуре 4ºС до использования.

    Во все пробирки (7 штук) наливают по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку вносят 0,5 мл сыворотки – получается сыворотка разведением 1: 2. Отсюда 0,5 мл смеси переносят во вторую пробирку – получается сыворотка разведением 1: 4, и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл смеси удаляют в дезинфицирующий раствор. Затем во все пробирки вносят по 1 капле диагностикума (взвесь убитых или живых бактерий), встряхивают и оставляют при комнатной температуре или инкубируют при 37ºС на 18 – 20 часов. Обязательные контроли – сыворотка без диагностикума и диагностикум без сыворотки.

    При положительном результате реакции на дне пробирки виден осадок в виде «перевернутого зонтика», а при отрицательном – осадок в виде «пуговицы».

    Ориентировочная реакция агглютинации служит для предварительного определения вида микроба. На стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной сыворотки (содержащей только специфические антитела). Сыворотку наносят в разведении 1: 100 и рядом – каплю физиологического раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе капли и размешивают. Через 2 - 4 минуты учитывают результат. При положительной реакции (соответствии исследуемой культуры диагностической сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости. В контроле – равномерная муть. Реакцию ставят перед постановкой развернутой РА для идентификации микроба.

    Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) заключается в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат в виде перевернутого зонтика.

    Реакция преципитации. В ней участвуют мелкодисперсные антигены (преципитиногены), которые связываются с соответствующими антителами (преципитинами). Чаще всего эту реакцию применяют для выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела – преципитины. Это качественный метод исследования. В узкую преципитационную пробирку добавляют стандартную иммунную сыворотку и на нее осторожно наслаивают жидкость, содержащую определяемый антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца (преципитина) свидетельствует о наличии антигена (например, возбудителя сибирской язвы в реакции Асколи) в исследуемой жидкости. Преципитат возникает вследствие укрупнения коллоидных частиц антигена. Иногда эту реакцию называют кольцепреципитацией. Важным условием образования нерастворимого комплекса антиген – антитело является:

1. полная прозрачность жидкостей,

2. эквивалентное соотношение ингредиентов, так как образующийся комплекс растворяется в избытке антигена или антитела.

 

III. Вакцины и сыворотки.

Токсинообразование у микроорганизмов:

 

Выделяют экзотоксин	Образуют эндотоксин
Clostridium tetanus	Escherichia coli
Clostridium perfringens	Salmonella typhi abdominalis
Clostridium botulinus	Shigella flexneri
Clostridium diphtheriae	Neisseria meningitidis

 

    Среди препаратов различают:

1. вакцины и анатоксины – препараты вызывающие в организме специфический иммунный ответ с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

2. иммунные сыворотки и иммуноглобулины – препараты, содержащие готовые специфические антитела (иммуноглобулины), введение которых в организм приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины.

Иммунные сыворотки и получаемые из них иммуноглобулины – биологические препараты, содержащие антитела. Они предназначены для создания пассивного антитоксического, антибактериального или антивирусного иммунитета у человека, нуждающегося в защите от инфекции или других потенциально – опасных веществ, обладающих антигенными свойствами.

 

Все сывороточные препараты делятся на две группы: гетерологичные, полученные из крови животных, и гомологичные, полученные из крови человека. Эти различия имеют принципиальное значение, так как гетерологичные препараты являются для организма человека чужеродными антигенами. Их применение сопровождается развитием антител, которые могут не только нейтрализовать действие препарата, но и вызвать в организме тяжелые аллергические и иммунокомплексные реакции.

Классификация вакцин

 

Группа вакцин по способам приготовления	Бактериальные вакцины	Вирусные вакцины
Живая (аттенуированная)	Туберкулезная – BCG Чумная Сибиреязвенная Туляремийная Бруцеллезная	Коревая Антирабическая Оспенная Паратитная Полиомиелитная I, II и III типов. Против желтой лихорадки.
Инактивированная	Лептоспирозная Коклюшная Гонококковая Бруцеллезная	Гриппозная Против клещевого энцефалита
Анатоксин	Стафилококковый Дифтерийный (АД) Столбнячный (АС) Секстаанатоксин Комбинированные препараты: дифтерийно - столбнячный (АДС), коклюшно – дифтерийно – столбнячный (АКДС)
Химическая (субъединичная)	Сыпно-тифозная Холерная (холероген + О-антиген) Менингококковая Брюшнотифозная	Гриппозная и др.
Рекомбинантная		Гриппозная и др.
Генно – инженерная		Против гепатита В