Методы культивирования вирусов в лаборатории, метод индикации репродукции вирусов

Культивирование вирусов в лаборатории возможно:

- Культивирование вирусов в организме лабораторных животных: лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных выводят из эксперимента, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных.

- Культивирование вирусов в куриных эмбрионах: большинство известных вирусов обладают способностью реплицироваться в курином эмбрионе. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования.

- Культивирование вирусов в тканевых культурах: клеточная культура– система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии.

Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

Сущность методов при приготовлении первичных культур тканей заключается в разрушении межклеточной ткани и разобщения клеток для последующего получения монослоя. Разобщение клеток проводится путём воздействия на ткань протеолитических ферментов (трипсина).

Методы индикации вирусов:

- нейтрализации цитопатического действия (ЦПД);

- нейтрализация реакции гемадсорбции;

- торможение реакции гемагглютинации;

- нейтрализация в опытах на животных.

- серологические– для обнаружения как специфических Ат, так и вирусных Аг;

- ПЦР(полимеразная цепная реакция) - данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей;

- люминисцентная микроскопия;

- метод цветной пробы.

Практические навыки: этапы окраски мазка по Граму, какие свойства изучаются, интерпретация результатов

Этапы окраски по Граму:
- генцианвиолет (40 сек)
- раствор люголя - спирт 96˚ (20-25 сек)
- промывка водой
- фуксин (2-3 мин)
- капля масла

Тинкториальные свойства – отношение к окраске по Граму. Различают Грам +(синего цвета) и Грам – (красного цвета) Из-за многослойного муреинового каркаса Грам+ не успевают обесцветиться спиртом и окрашиваются в синий цвет, а Грам – обесцвечиваются спиртом и докрашиваются фуксином в красный цвет.
№14

Основные методы диагностики инфекционных болезней

1. Бактериоскопия (микроскопия), вирусоскопия(электроннаямикроскопия)

2. Бактериологическое (выделение чистой культуры).

3. Паразитологическое исследование (микроскопия и гельминтоовоскопия).

4. Биологический метод (заражение животных).

5. Вирусологическая диагностика (выделение вирусов и токсинов):

А) цитопатическое действие на культуру клеток (ЦПД);

Б) реакция нейтрализации летального эффекта на чувствительных животных и куриных эмбрионах;

6. Серологическая диагностика (идентификация при помощи иммунной диагностической сыворотки):

A) реакция агглютинации развернутая (РА);

Б) ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации;

B) реакция непрямой гемагглютинации (РНГА);

Г) реакция гемагглютинации (РГА) и реакция гемадсорбции (РГАдс);

Д) реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и гемадсорбции (РТГАдс);

7. Иммунологическая диагностика (идентификация антигенов и антител):

A) имуноферментный анализ (ИФА);

Б) иммуноферритиновая реакция;

В) реакция преципитации (РП):

Г) иммуноблотинг;

8. Метод генной диагностики:

· полимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амплификация

9. Экспресс-методы:

А) иммунологический (МФА,.РНТА, ИФМ);

Б) бактериоскопический.

10. Алергологическая диагностика:

А) Кожные пробы со специфическими аллергенами (тулярин, туберкулин, бруцеллин, дизентерии).