Влияние препарата Лаеннек на активность МПО в печеночной ткани мышей, получивших конканавалин А

Чтобы изучить влияние препарата Лаеннек на повреждение печени, вызванное конканавалином А, в ответ на печеночный рекрутинг нейтрофилов и экспрессию оксида азота (NO), измеряли содержание МПО после внутримышечного введения препарата Лаеннек мышам, получившим Кон А. После введения препарата Лаеннек, содержание МПО снизилось вдвое (Рис.4).

Влияние препарата Лаеннек на содержание NO в печеночной ткани мышей, получивших конканавалин А

Чтобы определить, может ли препарат Лаеннек влиять на экспрессию медиатора воспаления, мы изучили влияние препарата Лаеннек на уровень NO в печеночной ткани мышей, получивших конканавалин А, после внутримышечной инъекции препарата Лаеннек. После введения препарата Лаеннек, содержание NO снизилось на 56,0% (Рис. 5).

Ингибирование апоптоза гепатоцитов благодаря предварительному введению препарата Лаеннек in vivo.

Чтобы выяснить, связано ли защитное действие препарата Лаеннек с ингибированием апоптоза, исследовали фрагментацию ДНК. В группе, получавшей только препарат Кон А, выявлен типичный маркер длин ДНК, однако в группе, получавшей препарат Лаеннек этот показатель был значительно ниже (Рис. 6). Мы также определили, что влияние препарата Лаеннек на экспрессию генов bcl-2 и bax, связанных с апоптозом. Результаты ОТ-ПЦР показали, что Кон А значительно повышает соотношение bcl-2 / bax, а Лаеннек значительно понижает это соотношение.

Снижение экспрессии ICAM-1 благодаря предварительному введению препарата Лаеннек

Данные о том, что препарат Лаеннек демонстрирует защитное действие при цитотоксичности, индуцированной взаимодействием между гепатоцитами и лимфоцитами, побудили нас исследовать вопрос, регулирует ли он экспрессию ICAM-1. Экспрессию ICAM-1 индуцировали путем добавления надосадочной жидкости, полученной из лимфоцитов, обработанных препаратом Кон А, к гепатоцитам, а затем мы определяли влияние препарата Лаеннек. Как и предполагалось, после инкубации с препаратом Лаеннек в течение 24 ч экспрессия мРНК ICAM-1 снижалась на 53,13% (Рисунок 8). Подобным образом, хотя и в меньшей степени, Лаеннек снижал экспрессию белка ICAM-1 с помощью иммунногистохимического окрашивания в гепатоцитах (Рисунок 9).

Обозначения

Ration of bcl-2 and bax mRNA	Соотношение мРНК bcl-2 и bax
b-actin	Бета-актин
Control	Контрольная группа
Con A	Кон А
Laennec treated	Введение Лаеннек

Рисунок 7. Влияние препарата Лаеннек на экспрессию мРНК bcl-2 и bax в гепатоцитах.

Полоса 1 – группа Кон А (10 мг/кг), полоса 2 – группа Кон А+ Лаеннек (3,6 мл/кг), полоса 3 – контрольная группа.

*p<0,05 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Обозначения

Expression of ICAM-1 mRNA (b-actin)	Экспрессия мРНК ICAM-1 (бета-актин)
Control	Контрольная группа
Medium stimulated group	Группа, получившая стимуляцию средой
Laennec treated group	Группа, получившая Лаеннек

Рисунок 8. Влияние препарата Лаеннек на экспрессию мРНК ICAM-1 в гепатоцитах

Свежие изолированные гепатоциты (2,5X10⁵) высевали в 24-ячейковый планшет, через 24 часа тщательно убирали среду с помощью надосадочной жидкости, полученной из лимфоцитов, обработанных препаратом Кон А (20 мг/мл). Гепатоциты предварительно обрабатывали препаратом Лаеннек (1 мл/мл) за 1 ч до добавления лимфоцитов.

Полоса 1 – контрольная группа, полоса 2 – группа, получившая стимуляцию средой, полоса 3 – группа, предварительно получившая Лаеннек (1мл/мл).

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившая стимуляцию средой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартное отклонение.

Обозначения

Grey level of ICAM-1 expression	Серый уровень экспрессии ICAM-1
Control	Контрольная группа
Medium stimulated group	Группа, получившая стимуляцию средой
Laennec treated group	Группа, получившая Лаеннек

Рисунок 9. Иммунногистохимическое окрашивание ICAM-1в гепатоцитах.

Клетки, окрашенные в коричневый цвет, считались положительным результатом. Серый уровень отражает степень экспрессии ICAM-1 и показывает обратно-пропорциональную связь между ними. Фото A—C увеличение X200, полоса=50 мм. ##p<0.01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившая стимуляцию средой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартное отклонение.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы исследовали влияние препарата Лаеннек на цитотоксичность в печени, индуцированную препаратом Кон А, и возможный молекулярный механизм этого влияния in vivo и in vitro. Полученные нами результаты показывают, Лаеннек значительно подавлял активность цитоплазматических ферментов (АЛТ, ЛДГ, МПО, NO) и восстанавливал показатели параметров, связанных с окислением (СОД и МДА). В то же самое время препарат Лаеннек ингибировал апоптоз в гепатоцитах, индуцированный Кон А. Кроме того, наши результаты также показывают, что Лаеннек подавлял экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах, что позволяет предположить, что Лаеннек участвует в регулировании молекул, связанных с иммунитетом.

Результаты исследования in vivo показывают, что предварительное введение препарата Лаеннек значительно улучшает состояние при остром поражении печени, индуцированном препаратом Кон А, что видно по снижению активности АЛТ и ЛДГ (Рис. 1). В соответствии с результатами исследования in vivo, Лаеннек также подавляет цитотоксичность, вызванную взаимодействием между гепатоцитами, обработанными Кон А, и лимфоцитами селезенки, стимулированными Кон А (Рисунок 2).

Считается, что ICAM-1/LFA-1 играет решающую роль в индукции апоптоза через Fas/перфорин-опосредованный путь при цитотоксичности, опосредованной Т-клетками (15, 16). Наличие антител к ICAM-1/LFA-1 почти полностью устраняет повреждение печени in vivo и частично подавляет цитотоксичность (примерно на 50%) in vitro (13), что означает, что в упомянутом взаимодействии участвуют и другие молекулы. Из более ранних публикаций видно, что Кон А связывается с главным комплексом гистосовместимости (ГКГС) мышей, чтобы имитировать его антигенные свойства (17), что объясняет, почему активированные Т-клетки распознают только гепатоциты, активированные Кон А (13). Таким образом, как связывание Кон А с гепатоцитами, так и взаимодействие ICAM-1/LFA-1 играет важную роль в развитии цитотоксичности печени, а это служит главным теоретическим обоснованием нашей модели in vitro (цитотоксичность, индуцированная взаимодействием между гепатоцитами, обработанными Кон А, и лимфоцитами, активированными Кон А. Цитотоксичность, индуцированная взаимодействием между гепатоцитами и лимфоцитами, значительно снижается благодаря предварительному введению препарата Лаеннек. Планируются дополнительные исследования, чтобы узнать, регулирует ли препарат Лаеннек экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах. Воспалительные цитокины апрегулируют экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах (20) и при адгезии Т-лимфоцитов (18, 19). Цитокины, полученные из активированных лимфоцитов при совместной культивации с лимфоцитами, обработанными препаратом Кон А, обязательно повлияют на гепатоциты. В связи с этим мы использовали лимфоциты, обработанные препаратом Кон А (20 мг/мл), чтобы индуцировать экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах. Результаты исследования in vitro показали, что Лаеннек даунрегулировал экспрессию ICAM-1 либо на генном (Рис. 7), либо на белковом уровне (Рис.8). Это может объяснять повышенную выживаемость гепатоцитов в совместных культурах гепатоцитов и лимфоцитов (Рис. 2).

Лаеннек подавлял перекисное окисление липидов и повышал уровень антиоксидантов. Во время воспаления нейтрофилы и клетки Купффера производят несколько видов реактивного кислорода, который вызывает перекисное окисление липидов (20). Хотя выраженность перекисного окисления липидов in vivo недостаточна для прямого повреждения клеток, перекисное окисление липидов – это мощный хемотаксический фактор нейтрофилов, который участвует в рекрутинге нейтрофилов и в ухудшении поражения печени (21, 22). Как показывают результаты нашего исследования in vivo, препарат Лаеннек повышал активность СОД и снижал уровень МДА в тканях печени мышей, получивших Кон А (Рис. 3). Это, а также то, что Лаеннек даунрегулировал экспрессию ICAM-1, помогает объяснить ингибирование апоптоза in vivo (Рис. 6, 7). Белок bcl-2 – это антиапоптозный фактор, а bax инактивирует bcl-2, связываясь с ним и образуя гетеродимер. Соотношение мРНК bcl-2 к bax – это ключевой фактор, позволяющий определить, будет ли апоптоз происходить в клетках или нет (23, 24). NO опосредует повреждение тканей путем ингибирования митохондриального дыхания, инактивации ингибиторов протеиназы и образования свободных радикалов (25), то есть NO – это весьма токсичное для клеток вещество. Предварительное введение препарата Лаеннек значительно снижало содержание NO в печени, что значимо снижало повреждение печени, в сравнении с контрольной группой. Кроме того, Лаеннек значительно снижал уровень МПО, повышенный вследствие приема препарата Кон А in vivo (Рис. 4). А это значит, что Лаеннек снижал инфильтрацию лейкоцитов в месте воспаления. Все упомянутые выше результаты показывают, что Лаеннек может оказывать гепатопротекторное действие, улучшая активность эндогенного антиоксидантного фермента.

В заключении можно сказать, что Лаеннек оказывает защитное действие при повреждениях печени, индуцированных введением препарата Кон А in vitro и in vivo, возможно, благодаря подавлению воспалительных реакций и апоптоза. Кроме того, Лаеннек также даунрегулирует экспрессию ICAM-1. Наши результаты дают новое понимание механизмов действия препарата Лаеннек как антигепатитного средства при иммунно-опосредованном гепатите, а дальнейшие исследования дадут болшье информации, которая позволит установить его безопасность и клинические возможности.

Слова благодарности.

Автор хотел бы поблагодарить персонал факультета клинической фармакологии Далянского медицинского университета за помощь.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Wolf H. K., Zargegar R., Oliver L., Michalopoulos G. K., Am. J. Pathol., 138, 1035—1043 (1991).

Qu J., Thomas K., J. Clin. Endocrinol. Metab., 77, 925—931 (1993). Uehara Y., Minowa O., Mori C., Shiota K., Kuno T., Kitamura N., Na­ture (London) 373, 702—705 (1993).

Saito S., Sakakura S., Enomoto M., Ichijo M., Matsumoto K., Naka- mura T., J. Biochem. (Tokyo), 117, 671—676 (1995). Hoffman G. E., Scott R. T., Bergh P. A., Am. J. Obstet. Gynecol., 73, 882—887 (1991).

Lysiak J. J., Han V. K. M., Lala P. K., Biol. Reprod., 49, 885—894 (1993).

Charles A. F., Linda L. D., Chester A. M., Diane M. S., Michael B. S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 3676—3680 (1983). Liu K. X., Kato Y., Kaku T. I., Sugiyama Y., Biol. Pharm. Bull., 21, 44—49 (1998).

Tiegs G., Hentschel J., Wendel A., J Clin. Invest., 90, 196—203 (1992).

Gantner F., Leist M., Lohse A. W., Germann P. G., Tiegs A., Hepatol- ogy, 21, 190—198 (1995).

Kflsters S., Gantner F., Kflnstle G., Tiegs G., Gastroenterology, 111, 462—471 (1996).

Leist M., Wendel A., J. Hepatol., 25, 948—959 (1996). Watanabe Y., Morita M., Akaike T., Hepatology, 24, 702—710 (1996). Kato Y., Liu K. X., Nakamura T., Sugiyama Y., Hepatology, 20, 417— 422 (1994).

Kagi D., Vignaux F., Ledermann B., Burki K., Depraetere V., Nagata S., Hengartner H., Science, 265, 528—530 (1994). Lowin B., Hahne M., Mattmann C., Tschopp J., Nature (London), 370, 650—652 (1994).

Berke G., McVey E., Hu V, Clark W. R., J Immunol., 127, 782—787 (1981).

Volopes R., Vanden Oord J. J., Desmet V J., Hepatology, 12, 148—154 (1990).

Sano K., Nagaki M., Sugiyama A., Hatakeyama H., Ohnishi H., Muto Y., Moriwaki H., Dig. Dis. Sci., 44, 796—805 (1999). Grace S. U., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 283, 256— 265 (2002).

Mathews W. R., Guido D. M., Fisher M. A., Jaeschke H., Free Radic. Biol. Med., 16, 763—770 (1994).

Wang Y., Mathews W. R., Guido D. M., Jaeschke H., J. Pharmacol. Exp. Ther, 277, 714—720 (1996).

Li J., Billiar T. R., Am. J. Physiol., 276, 1069—1073 (1999). Cheng B., Yang X., Hou Z., Lin X., Meng H., Li Z., Liu S., Auton. Neurosci, 134, 38—44 (2007).

Marshall H. E., Merchant K., Stamler J. S., FASEB J., 14, 1889—1900 (2000).

 

[ОБ1]Прим.пер. Присланный файл оригинала сильно поврежден. Текст на странице написан в виде несвязанных между собой отрывков.

Определить, к какой части текста относится то или иное выражение практически невозможно. Поэтому я буду переводить эти отрывки так, как они появляются на странице, если не смогу идентифицировать отрывок текста, к которому они относятся.

[ОБ2]См. пред.прим. Последняя строчка в тексте оригинала написана двумя абзацами раньше, но она, очевидно, подходит сюда.

Далее абзац неожиданно обрывается. Начинается новый подзаголовок Влияние препарата Лаеннек на активность цитозольных…, а продолжение абзаца находится уже на следующей странице.

[ОБ3]Прим. пер.: далее идет отрывок текста, который начинается с фразы «введение препарата Лаеннек…», но начало абзаца находится на предыдущей странице.

[U4]Рисунки расположены на странице в хаотичном порядке, частично накладываясь друг на друга, поэтому не всегда можно определить, какая надпись относится к какому рисунку

[U5]Это примечание к одному из рисунков на странице, но не понятно к какому.

[U6] Надпись на странице присутствует, но рисунка к ней нет

[U7]Надпись расположена на предыдущей странице. Нельзя определить точно, относится ли она именно к этому рисунку