Определение просачивания биохимических маркеров — КиберПедия 

Особенности сооружения опор в сложных условиях: Сооружение ВЛ в районах с суровыми климатическими и тяжелыми геологическими условиями...

Индивидуальные и групповые автопоилки: для животных. Схемы и конструкции...

Определение просачивания биохимических маркеров

2017-09-29 189
Определение просачивания биохимических маркеров 0.00 из 5.00 0 оценок
Заказать работу

Использование препарата Лаеннек оказывает защитное действие при повреждениях печени у мышей, вызванных приемом препарата Конканавалин А, благодаря ингибированию воспалительных реакций и апоптоза гепатоцитов.

Цзинцзин Уа, Тао ЯНГа, Чаньгуань ВАНа, Ци Люа, Цзихон ЯОа, Хуйцзунь СУНЬа, Тай-ичи КАКУb, Ке-Син ЛЮа

А – факультет клинической фармакологии, фармацевтический институт, Далянский медицинский институт, Liaoning, 9 West Section, Lvshun South Road, Lvshunkou District, Dalian 116044,КНР и bДжапан Байопродактс Индастри Ко Лтд, 1-44-4 Tomigaya, Shibuya-ku, Tokyo 151-0063, Япония

Получено: 11 апреля 2008 года

Принято в печать: 8 августа 2008 года

Опубликовано в сети Интернет: 20 августа 2008 года.

Действие препарата Лаеннек, гидролизата человеческой плаценты, при иммунно-опосредованных повреждениях печени исследовали in vivo и in vitro на мышах. Для провокации повреждения печени in vivo использовали препарат Конканавалин А, который вводили в хвостовую вену. Гепатотоксичность in vitro изучали после взаимодействия между гепатоцитами, которые обработали Кон А, и аутологичными селезеночными лимфоцитами, стимулированными Кон А, в течение 8 часов. В обоих случаях заранее вводили Лаеннек. Лаеннек снижал активность биохимических маркеров (аланин аминотрансферазы – АЛТ, лактат дегидрогеназы – ЛДГ) в сыворотке крови и восстанавливал активность супероксиддисмутазы (СОД) и миелопероксидазы (МПО), а также содержание малондиальдегида (МДА) и оксида азота (NO) в тканях печени. Мы также обнаружили, что Лаеннек уменьшает фрагментацию ДНК, индуцированную Кон А in vivo. Кроме того, просачивание аспартат аминотрансферазы (АСТ) и ЛДГ в надосадочную жидкость в системе кокультивирования уменьшается после добавления препарата Лаеннек. Анализ фрагментации ДНК и эксперимент по индукции/ингибированию молекулы межклеточной адгезии - 1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule - 1) раскрыли возможный защитный механизм препарата. Результаты исследования показали, что Лаеннек ингибирует ICAM-1, которая связана с взаимодействием между гепатоцитами и лимфоцитами. Эти результаты указывают, что Лаеннек обладает мощным действием при иммунно-опосредованных повреждениях печени.

Ключевые слова: Лаеннек; гепатит, вызванный примемом Конканавалина А; апоптоз; молекула межклеточной адгезии – 1

 

В последние годы стало очевидно, что человеческая плацента – это источник большого количества биологически активных молекул (1), например, фактора роста гепатоцитов (ФРГ) (1,4), эпидермальный фактор роста (ЭФР) (5), трансформирующий ростовой фактор – альфа (ТРФ-а) и трансформирующий ростовой фактор неразборчиво (ТРФ -??) (7). Лаеннек получает путем очищения человеческой плаценты; процесс очищения включает диализ, тепловую обработку и гидролиз. Хотя Лаеннек представляет собой смесь нескольких анионных кислот, но не содержит ФРГ, он в значительной мере стимулирует регенерацию печени in vivo и in vitro (8), что позволяет предположить наличие мощных митогенов для гепатоцитов в составе препарата Лаеннек. Инъекции Лаеннека использовали в Японии в клинической практике для лечения хронического повреждения печени и цирроза печени на протяжении 40 лет. Однако о его антииммунном действии известно немногое, таким образом, разработка этого нового фарамакологического действия представляет большую ценность.

Конканавалин А (Кон А) индуцирует селективную печеночную недостаточность, которая характеризуется наличием поликлонально активированных Т-клеток, за которой следует системное высвобождение цитокинов (9-11). Как сообщалось ранее, Кон А прочно связывается с мембраной гепатоцитов, что согласуется со степенью гепатотоксичности, вызванной приемом препарата Кон А (12). Это происходит потому, что связывание с Кон А не только производит прямой токсический эффект на первичные гепатоциты независимо от наличия Т-клеток, но и повышает чувтсвительность гепатоцитов к ативированным аутологичным лимфоцитам (13). Как активация лимфоцитов, так и связывание гепатоцитов с Кон А важны для развития цитотоксичности. Гепатоциты сначала сенсибилизируются препаратом Кон А или даже погибают вследствие введения Кон А в большой концентрации, а затем взаимодействуют с поликлонально активированными Т-клетками, что приводит к апоптозу и даже к некрозу. Взаимодействие между гепатоцитами и лимфоцитами, в основном, опосредуется взаимодействием между молекулой межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и LFA-1 (интегрином αLβ2). (13) До некоторой степени, патогенез этой модели гепатита напоминает иммунно-опосредованный гепатит у человека, например аутоиммунный и вирусный гепатит.

Настоящее исследование проводили для изучения защитного действия препарата Лаеннек при гепатите, индуцированном Кон А. Результаты исследования in vivo и in vitro показали, что профилактическое введение препарата Лаеннек значительно улучшает состояние при повреждениях печени благодаря снижению воспалительной реакции и ингибированию апоптоза гепатоцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и реактивы. Самки мышей линии BALB/с и самки крыс линии Вистар (из Центра экспериментальных животных Далянского медицинского университета, Далян, Китай) содержались в строгом соответствии с принципами Национального учреждения здравоохранения по проведению экспериментов с использованием животных. Препарат Кон А и коллагеназу получили из компании Вако (Япония); препарат Лаеннек закупили в компании Джапан Байопродактс Индастри Ко Лтд (Токио, Япония). Противо-крысиное антитело к ICAM-1 приобрели в компании Бостер Байолоджикал Текнолоджи Ко Лтд (Ухань, Китай). Информация о других реактивах будет приведена далее при их упоминании в тексте.

Протокол исследования. In vivo. Повреждение печени у мышей индуцировали с помощью инъекции препарата Кон А (10 мг/кг), растворенного в физиологическом растворе, в хвостовую вену. Препарат Лаеннек вводили внутримышечно животным за 30 минут до введения препарата Кон А. Повреждение гепатоцитов исследовали через 8 ч после приема Кон А. Мышам из контрольной группы вводили тот же объем физиологического раствора.

In vitro. Изолировали гепатоциты, полученные от самок крыс линии Вистар, массой тела 130-160 г, с помощью двухэтапного метода перфузии с коллагеназой (14). У той же крысы удаляли сеслезенку, из которой добывали лимфоциты с помощью раствора для сепарации лифмоцитов (Лимфоцит-Крыса, Тьяньцзинь Хаоян Байо Ко Лтд, Китай). Смесь лимфоцитов инкубировали в течение 3 ч для адгезии клеток, а затем слипшиеся клетки удаляли. Гепатоциты предварительно обрабатывали препаратом Кон А (20 мг/мл). Через 24 часа аутологичные лимфоциты (1.25 X107 клеток/мл), активированные препаратом Кон А (20 мг/мл) в течение 48 часов, добавляли к гепатоцитам, а затем инкубировали их совместно в соотношении лимфоцитов/гепатоцитов 10:1 в течение 8 ч. В эксперименте с ICAM-1 консервированную надосадочную жидкость от лимфоцитов, активированных препаратом Кон А (20 мг/мл) добавляли к гепатоцитам и инкубировали в течение 8 ч (группа, получившая стимуляцию средой). С помощью препарата Лаеннек (1 мл/мл) предварительно обрабатывали гепатоциты за 1 ч до добавления препарата Кон А.

Определение супероксиддисмутазы (СОД), малондиальдегида (МДА), миелопероксидазы (МПО) и оксида азота (NO) в тканях печени.

Получали образцы печени, которые потом взвешивали и гомогенизировали на льду через 8 ч после приема Кон А. Исследования СОД, МДА, МПО и NO проводили с помощью аналитических наборов (Биоинженерный институт Нанкин Цзяньчэн, Нанкин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Белок определяли с помощью метода Лоури.

Скорость ингибирования (I) рассчитывали с помощью следующей формулы (уравнение 1), где V представляет полученные значения АСТ, ЛДГ, СОД, МДА, МПО и NO в контрольной группе, группе, получившей только Кон А, или группе, получившей Лаеннек, соответственно.

Ноябрь 2008[ОБ1] (1)

Статистический анализ

Все данные представлены в виде среднего± стандартная ошибка средней (in vivo) и среднего±СО (in vivo) и анализировали с помощью дисперсионного анализа с использованием критерия Стьюдента (односторонний критерий). Статический анализ проводили с помощью программы SPSS 11.5 (SPSS, Чикаго, США). Различие в Р<0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ[ОБ3]

Обозначения

ALT АЛТ
LDH ЛДГ
IU/l ME/л
Control Контрольная группа
Con A Кон А
Con A+Laennec Кон А + Лаеннек

Рисунок 1. Влияние препарата Лаеннек на уровень АЛТ (А) и ЛДГ (В) в сыворотке крови у мышей линии BALB/c

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05, **p<0,01 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее восьми повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Обозначения

ALT АЛТ
LDH ЛДГ
IU/l ME/л

Рисунок [U4] 2. Влияние препарата Лаеннек на цитотоксичность, индуцированную взаимодействием гепатоцитов, обработанных Кон А и активированных аутологичных лимфоцитов.

Модель [U5] in vitroсоздали путем совместной культивации гепатоцитов, обработанных препаратом Кон А (20 мг/мл), и лимфоцитов, стимулированных препаратом Кон А (20 мг/мл). Клетки инкубировали соместно в течение 8 ч, а затем определяли уровень АСТ (А) и ЛДГ (В) в надосадочной жидкости. Гепатоциты предварительно обработали препаратом Лаеннек (1 мл/мл) в течение 1 ч до введения препарата Кон А. Через 24 ч гепатоциты снова промывали до проведения реакции взаимодействия в присутствии того же исследуемого соединения. Холостая группа (□); контрольная группа: гепатоциты обрабатывали только препаратом Кон А(20 мг/мл) (ED); исследуемая группа (□); группа, получавшая Лаеннек. H+ - гепатоциты, стимулированные препаратом Кон А; H – гепатоциты, не подвергшиеся обработке; L+ - лимфоциты, активированные препаратом Кон А. ##p<0.01, ###p<0.001 в сравнении с холостой и контрольной группой; *p<0.05, **p<0.01 в сравнении с исследуемой группой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Обозначения

SOD СОД
MDA МДА
U/mg protein Ед/мг белка
nmol/mg protein Нмоль/мг белка
Control Контрольная группа
Con A Кон А
Con A+Laennec Кон А + Лаеннек

Рисунок 3. Влияние препарата Лаеннек на уровень СОД (А) и МДА (В)

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; **p<0,01 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее шести повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Обозначения

МРО МПО
IU/l ME/л
Control Контрольная группа
Con A Кон А
Con A+Laennec Кон А + Лаеннек

Рисунок 4. Влияние препарата на уровень МПО в тканях печени мышей.

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее шести повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего

Рисунок 5. Влияние препарата на уровень NO в тканях печени мышей[U6].

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05, **p<0,01 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее восьми повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего

Рисунок [U7] 6. Электрофорез в агаровом геле для определения фрагментации ДНК. Полоса 1 – группа Кон А (10 мг/кг), полоса 2 – группа Кон А+ Лаеннек (3,6 мл/кг), полоса 3 – контрольная группа.

Влияние препарата Лаеннек на активность СОД и содержание МДА в печеночной ткани мышей, получивших конканавалин А

Для изучения антиоксидантного действия препарата Лаеннек на гепатит, вызванный конканавалином А, мы исследовали активность СОД и продукцию МДА в тканях печени. В сравнении с контрольной группой, уровень СОД в печени мышей из группы Кон А повышался на 41,94% (Рис. 3А), а содержание МДП снизилось на 47,86% (Рис. 3В).

Обозначения

Ration of bcl-2 and bax mRNA Соотношение мРНК bcl-2 и bax
b-actin Бета-актин
Control Контрольная группа
Con A Кон А
Laennec treated Введение Лаеннек

Рисунок 7. Влияние препарата Лаеннек на экспрессию мРНК bcl-2 и bax в гепатоцитах.

Полоса 1 – группа Кон А (10 мг/кг), полоса 2 – группа Кон А+ Лаеннек (3,6 мл/кг), полоса 3 – контрольная группа.

*p<0,05 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Обозначения

Expression of ICAM-1 mRNA (b-actin) Экспрессия мРНК ICAM-1 (бета-актин)
Control Контрольная группа
Medium stimulated group Группа, получившая стимуляцию средой
Laennec treated group Группа, получившая Лаеннек

Рисунок 8. Влияние препарата Лаеннек на экспрессию мРНК ICAM-1 в гепатоцитах

Свежие изолированные гепатоциты (2,5X105) высевали в 24-ячейковый планшет, через 24 часа тщательно убирали среду с помощью надосадочной жидкости, полученной из лимфоцитов, обработанных препаратом Кон А (20 мг/мл). Гепатоциты предварительно обрабатывали препаратом Лаеннек (1 мл/мл) за 1 ч до добавления лимфоцитов.

Полоса 1 – контрольная группа, полоса 2 – группа, получившая стимуляцию средой, полоса 3 – группа, предварительно получившая Лаеннек (1мл/мл).

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившая стимуляцию средой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартное отклонение.

Обозначения

Grey level of ICAM-1 expression Серый уровень экспрессии ICAM-1
Control Контрольная группа
Medium stimulated group Группа, получившая стимуляцию средой
Laennec treated group Группа, получившая Лаеннек

Рисунок 9. Иммунногистохимическое окрашивание ICAM-1в гепатоцитах.

Клетки, окрашенные в коричневый цвет, считались положительным результатом. Серый уровень отражает степень экспрессии ICAM-1 и показывает обратно-пропорциональную связь между ними. Фото A—C увеличение X200, полоса=50 мм. ##p<0.01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05 в сравнении с группой, получившая стимуляцию средой. Каждое значение представляет среднее трех повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартное отклонение.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы исследовали влияние препарата Лаеннек на цитотоксичность в печени, индуцированную препаратом Кон А, и возможный молекулярный механизм этого влияния in vivo и in vitro. Полученные нами результаты показывают, Лаеннек значительно подавлял активность цитоплазматических ферментов (АЛТ, ЛДГ, МПО, NO) и восстанавливал показатели параметров, связанных с окислением (СОД и МДА). В то же самое время препарат Лаеннек ингибировал апоптоз в гепатоцитах, индуцированный Кон А. Кроме того, наши результаты также показывают, что Лаеннек подавлял экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах, что позволяет предположить, что Лаеннек участвует в регулировании молекул, связанных с иммунитетом.

Результаты исследования in vivo показывают, что предварительное введение препарата Лаеннек значительно улучшает состояние при остром поражении печени, индуцированном препаратом Кон А, что видно по снижению активности АЛТ и ЛДГ (Рис. 1). В соответствии с результатами исследования in vivo, Лаеннек также подавляет цитотоксичность, вызванную взаимодействием между гепатоцитами, обработанными Кон А, и лимфоцитами селезенки, стимулированными Кон А (Рисунок 2).

Считается, что ICAM-1/LFA-1 играет решающую роль в индукции апоптоза через Fas/перфорин-опосредованный путь при цитотоксичности, опосредованной Т-клетками (15, 16). Наличие антител к ICAM-1/LFA-1 почти полностью устраняет повреждение печени in vivo и частично подавляет цитотоксичность (примерно на 50%) in vitro (13), что означает, что в упомянутом взаимодействии участвуют и другие молекулы. Из более ранних публикаций видно, что Кон А связывается с главным комплексом гистосовместимости (ГКГС) мышей, чтобы имитировать его антигенные свойства (17), что объясняет, почему активированные Т-клетки распознают только гепатоциты, активированные Кон А (13). Таким образом, как связывание Кон А с гепатоцитами, так и взаимодействие ICAM-1/LFA-1 играет важную роль в развитии цитотоксичности печени, а это служит главным теоретическим обоснованием нашей модели in vitro (цитотоксичность, индуцированная взаимодействием между гепатоцитами, обработанными Кон А, и лимфоцитами, активированными Кон А. Цитотоксичность, индуцированная взаимодействием между гепатоцитами и лимфоцитами, значительно снижается благодаря предварительному введению препарата Лаеннек. Планируются дополнительные исследования, чтобы узнать, регулирует ли препарат Лаеннек экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах. Воспалительные цитокины апрегулируют экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах (20) и при адгезии Т-лимфоцитов (18, 19). Цитокины, полученные из активированных лимфоцитов при совместной культивации с лимфоцитами, обработанными препаратом Кон А, обязательно повлияют на гепатоциты. В связи с этим мы использовали лимфоциты, обработанные препаратом Кон А (20 мг/мл), чтобы индуцировать экспрессию ICAM-1 в гепатоцитах. Результаты исследования in vitro показали, что Лаеннек даунрегулировал экспрессию ICAM-1 либо на генном (Рис. 7), либо на белковом уровне (Рис.8). Это может объяснять повышенную выживаемость гепатоцитов в совместных культурах гепатоцитов и лимфоцитов (Рис. 2).

Лаеннек подавлял перекисное окисление липидов и повышал уровень антиоксидантов. Во время воспаления нейтрофилы и клетки Купффера производят несколько видов реактивного кислорода, который вызывает перекисное окисление липидов (20). Хотя выраженность перекисного окисления липидов in vivo недостаточна для прямого повреждения клеток, перекисное окисление липидов – это мощный хемотаксический фактор нейтрофилов, который участвует в рекрутинге нейтрофилов и в ухудшении поражения печени (21, 22). Как показывают результаты нашего исследования in vivo, препарат Лаеннек повышал активность СОД и снижал уровень МДА в тканях печени мышей, получивших Кон А (Рис. 3). Это, а также то, что Лаеннек даунрегулировал экспрессию ICAM-1, помогает объяснить ингибирование апоптоза in vivo (Рис. 6, 7). Белок bcl-2 – это антиапоптозный фактор, а bax инактивирует bcl-2, связываясь с ним и образуя гетеродимер. Соотношение мРНК bcl-2 к bax – это ключевой фактор, позволяющий определить, будет ли апоптоз происходить в клетках или нет (23, 24). NO опосредует повреждение тканей путем ингибирования митохондриального дыхания, инактивации ингибиторов протеиназы и образования свободных радикалов (25), то есть NO – это весьма токсичное для клеток вещество. Предварительное введение препарата Лаеннек значительно снижало содержание NO в печени, что значимо снижало повреждение печени, в сравнении с контрольной группой. Кроме того, Лаеннек значительно снижал уровень МПО, повышенный вследствие приема препарата Кон А in vivo (Рис. 4). А это значит, что Лаеннек снижал инфильтрацию лейкоцитов в месте воспаления. Все упомянутые выше результаты показывают, что Лаеннек может оказывать гепатопротекторное действие, улучшая активность эндогенного антиоксидантного фермента.

В заключении можно сказать, что Лаеннек оказывает защитное действие при повреждениях печени, индуцированных введением препарата Кон А in vitro и in vivo, возможно, благодаря подавлению воспалительных реакций и апоптоза. Кроме того, Лаеннек также даунрегулирует экспрессию ICAM-1. Наши результаты дают новое понимание механизмов действия препарата Лаеннек как антигепатитного средства при иммунно-опосредованном гепатите, а дальнейшие исследования дадут болшье информации, которая позволит установить его безопасность и клинические возможности.

Слова благодарности.

Автор хотел бы поблагодарить персонал факультета клинической фармакологии Далянского медицинского университета за помощь.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Wolf H. K., Zargegar R., Oliver L., Michalopoulos G. K., Am. J. Pathol., 138, 1035—1043 (1991).

Qu J., Thomas K., J. Clin. Endocrinol. Metab., 77, 925—931 (1993). Uehara Y., Minowa O., Mori C., Shiota K., Kuno T., Kitamura N., Na­ture (London) 373, 702—705 (1993).

Saito S., Sakakura S., Enomoto M., Ichijo M., Matsumoto K., Naka- mura T., J. Biochem. (Tokyo), 117, 671—676 (1995). Hoffman G. E., Scott R. T., Bergh P. A., Am. J. Obstet. Gynecol., 73, 882—887 (1991).

Lysiak J. J., Han V. K. M., Lala P. K., Biol. Reprod., 49, 885—894 (1993).

Charles A. F., Linda L. D., Chester A. M., Diane M. S., Michael B. S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 3676—3680 (1983). Liu K. X., Kato Y., Kaku T. I., Sugiyama Y., Biol. Pharm. Bull., 21, 44—49 (1998).

Tiegs G., Hentschel J., Wendel A., J Clin. Invest., 90, 196—203 (1992).

Gantner F., Leist M., Lohse A. W., Germann P. G., Tiegs A., Hepatol- ogy, 21, 190—198 (1995).

Kflsters S., Gantner F., Kflnstle G., Tiegs G., Gastroenterology, 111, 462—471 (1996).

Leist M., Wendel A., J. Hepatol., 25, 948—959 (1996). Watanabe Y., Morita M., Akaike T., Hepatology, 24, 702—710 (1996). Kato Y., Liu K. X., Nakamura T., Sugiyama Y., Hepatology, 20, 417— 422 (1994).

Kagi D., Vignaux F., Ledermann B., Burki K., Depraetere V., Nagata S., Hengartner H., Science, 265, 528—530 (1994). Lowin B., Hahne M., Mattmann C., Tschopp J., Nature (London), 370, 650—652 (1994).

Berke G., McVey E., Hu V, Clark W. R., J Immunol., 127, 782—787 (1981).

Volopes R., Vanden Oord J. J., Desmet V J., Hepatology, 12, 148—154 (1990).

Sano K., Nagaki M., Sugiyama A., Hatakeyama H., Ohnishi H., Muto Y., Moriwaki H., Dig. Dis. Sci., 44, 796—805 (1999). Grace S. U., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 283, 256— 265 (2002).

Mathews W. R., Guido D. M., Fisher M. A., Jaeschke H., Free Radic. Biol. Med., 16, 763—770 (1994).

Wang Y., Mathews W. R., Guido D. M., Jaeschke H., J. Pharmacol. Exp. Ther, 277, 714—720 (1996).

Li J., Billiar T. R., Am. J. Physiol., 276, 1069—1073 (1999). Cheng B., Yang X., Hou Z., Lin X., Meng H., Li Z., Liu S., Auton. Neurosci, 134, 38—44 (2007).

Marshall H. E., Merchant K., Stamler J. S., FASEB J., 14, 1889—1900 (2000).

 

[ОБ1]Прим.пер. Присланный файл оригинала сильно поврежден. Текст на странице написан в виде несвязанных между собой отрывков.

Определить, к какой части текста относится то или иное выражение практически невозможно. Поэтому я буду переводить эти отрывки так, как они появляются на странице, если не смогу идентифицировать отрывок текста, к которому они относятся.

[ОБ2]См. пред.прим. Последняя строчка в тексте оригинала написана двумя абзацами раньше, но она, очевидно, подходит сюда.

Далее абзац неожиданно обрывается. Начинается новый подзаголовок Влияние препарата Лаеннек на активность цитозольных…, а продолжение абзаца находится уже на следующей странице.

[ОБ3]Прим. пер.: далее идет отрывок текста, который начинается с фразы «введение препарата Лаеннек…», но начало абзаца находится на предыдущей странице.

[U4]Рисунки расположены на странице в хаотичном порядке, частично накладываясь друг на друга, поэтому не всегда можно определить, какая надпись относится к какому рисунку

[U5]Это примечание к одному из рисунков на странице, но не понятно к какому.

[U6] Надпись на странице присутствует, но рисунка к ней нет

[U7]Надпись расположена на предыдущей странице. Нельзя определить точно, относится ли она именно к этому рисунку

Использование препарата Лаеннек оказывает защитное действие при повреждениях печени у мышей, вызванных приемом препарата Конканавалин А, благодаря ингибированию воспалительных реакций и апоптоза гепатоцитов.

Цзинцзин Уа, Тао ЯНГа, Чаньгуань ВАНа, Ци Люа, Цзихон ЯОа, Хуйцзунь СУНЬа, Тай-ичи КАКУb, Ке-Син ЛЮа

А – факультет клинической фармакологии, фармацевтический институт, Далянский медицинский институт, Liaoning, 9 West Section, Lvshun South Road, Lvshunkou District, Dalian 116044,КНР и bДжапан Байопродактс Индастри Ко Лтд, 1-44-4 Tomigaya, Shibuya-ku, Tokyo 151-0063, Япония

Получено: 11 апреля 2008 года

Принято в печать: 8 августа 2008 года

Опубликовано в сети Интернет: 20 августа 2008 года.

Действие препарата Лаеннек, гидролизата человеческой плаценты, при иммунно-опосредованных повреждениях печени исследовали in vivo и in vitro на мышах. Для провокации повреждения печени in vivo использовали препарат Конканавалин А, который вводили в хвостовую вену. Гепатотоксичность in vitro изучали после взаимодействия между гепатоцитами, которые обработали Кон А, и аутологичными селезеночными лимфоцитами, стимулированными Кон А, в течение 8 часов. В обоих случаях заранее вводили Лаеннек. Лаеннек снижал активность биохимических маркеров (аланин аминотрансферазы – АЛТ, лактат дегидрогеназы – ЛДГ) в сыворотке крови и восстанавливал активность супероксиддисмутазы (СОД) и миелопероксидазы (МПО), а также содержание малондиальдегида (МДА) и оксида азота (NO) в тканях печени. Мы также обнаружили, что Лаеннек уменьшает фрагментацию ДНК, индуцированную Кон А in vivo. Кроме того, просачивание аспартат аминотрансферазы (АСТ) и ЛДГ в надосадочную жидкость в системе кокультивирования уменьшается после добавления препарата Лаеннек. Анализ фрагментации ДНК и эксперимент по индукции/ингибированию молекулы межклеточной адгезии - 1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule - 1) раскрыли возможный защитный механизм препарата. Результаты исследования показали, что Лаеннек ингибирует ICAM-1, которая связана с взаимодействием между гепатоцитами и лимфоцитами. Эти результаты указывают, что Лаеннек обладает мощным действием при иммунно-опосредованных повреждениях печени.

Ключевые слова: Лаеннек; гепатит, вызванный примемом Конканавалина А; апоптоз; молекула межклеточной адгезии – 1

 

В последние годы стало очевидно, что человеческая плацента – это источник большого количества биологически активных молекул (1), например, фактора роста гепатоцитов (ФРГ) (1,4), эпидермальный фактор роста (ЭФР) (5), трансформирующий ростовой фактор – альфа (ТРФ-а) и трансформирующий ростовой фактор неразборчиво (ТРФ -??) (7). Лаеннек получает путем очищения человеческой плаценты; процесс очищения включает диализ, тепловую обработку и гидролиз. Хотя Лаеннек представляет собой смесь нескольких анионных кислот, но не содержит ФРГ, он в значительной мере стимулирует регенерацию печени in vivo и in vitro (8), что позволяет предположить наличие мощных митогенов для гепатоцитов в составе препарата Лаеннек. Инъекции Лаеннека использовали в Японии в клинической практике для лечения хронического повреждения печени и цирроза печени на протяжении 40 лет. Однако о его антииммунном действии известно немногое, таким образом, разработка этого нового фарамакологического действия представляет большую ценность.

Конканавалин А (Кон А) индуцирует селективную печеночную недостаточность, которая характеризуется наличием поликлонально активированных Т-клеток, за которой следует системное высвобождение цитокинов (9-11). Как сообщалось ранее, Кон А прочно связывается с мембраной гепатоцитов, что согласуется со степенью гепатотоксичности, вызванной приемом препарата Кон А (12). Это происходит потому, что связывание с Кон А не только производит прямой токсический эффект на первичные гепатоциты независимо от наличия Т-клеток, но и повышает чувтсвительность гепатоцитов к ативированным аутологичным лимфоцитам (13). Как активация лимфоцитов, так и связывание гепатоцитов с Кон А важны для развития цитотоксичности. Гепатоциты сначала сенсибилизируются препаратом Кон А или даже погибают вследствие введения Кон А в большой концентрации, а затем взаимодействуют с поликлонально активированными Т-клетками, что приводит к апоптозу и даже к некрозу. Взаимодействие между гепатоцитами и лимфоцитами, в основном, опосредуется взаимодействием между молекулой межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и LFA-1 (интегрином αLβ2). (13) До некоторой степени, патогенез этой модели гепатита напоминает иммунно-опосредованный гепатит у человека, например аутоиммунный и вирусный гепатит.

Настоящее исследование проводили для изучения защитного действия препарата Лаеннек при гепатите, индуцированном Кон А. Результаты исследования in vivo и in vitro показали, что профилактическое введение препарата Лаеннек значительно улучшает состояние при повреждениях печени благодаря снижению воспалительной реакции и ингибированию апоптоза гепатоцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и реактивы. Самки мышей линии BALB/с и самки крыс линии Вистар (из Центра экспериментальных животных Далянского медицинского университета, Далян, Китай) содержались в строгом соответствии с принципами Национального учреждения здравоохранения по проведению экспериментов с использованием животных. Препарат Кон А и коллагеназу получили из компании Вако (Япония); препарат Лаеннек закупили в компании Джапан Байопродактс Индастри Ко Лтд (Токио, Япония). Противо-крысиное антитело к ICAM-1 приобрели в компании Бостер Байолоджикал Текнолоджи Ко Лтд (Ухань, Китай). Информация о других реактивах будет приведена далее при их упоминании в тексте.

Протокол исследования. In vivo. Повреждение печени у мышей индуцировали с помощью инъекции препарата Кон А (10 мг/кг), растворенного в физиологическом растворе, в хвостовую вену. Препарат Лаеннек вводили внутримышечно животным за 30 минут до введения препарата Кон А. Повреждение гепатоцитов исследовали через 8 ч после приема Кон А. Мышам из контрольной группы вводили тот же объем физиологического раствора.

In vitro. Изолировали гепатоциты, полученные от самок крыс линии Вистар, массой тела 130-160 г, с помощью двухэтапного метода перфузии с коллагеназой (14). У той же крысы удаляли сеслезенку, из которой добывали лимфоциты с помощью раствора для сепарации лифмоцитов (Лимфоцит-Крыса, Тьяньцзинь Хаоян Байо Ко Лтд, Китай). Смесь лимфоцитов инкубировали в течение 3 ч для адгезии клеток, а затем слипшиеся клетки удаляли. Гепатоциты предварительно обрабатывали препаратом Кон А (20 мг/мл). Через 24 часа аутологичные лимфоциты (1.25 X107 клеток/мл), активированные препаратом Кон А (20 мг/мл) в течение 48 часов, добавляли к гепатоцитам, а затем инкубировали их совместно в соотношении лимфоцитов/гепатоцитов 10:1 в течение 8 ч. В эксперименте с ICAM-1 консервированную надосадочную жидкость от лимфоцитов, активированных препаратом Кон А (20 мг/мл) добавляли к гепатоцитам и инкубировали в течение 8 ч (группа, получившая стимуляцию средой). С помощью препарата Лаеннек (1 мл/мл) предварительно обрабатывали гепатоциты за 1 ч до добавления препарата Кон А.

Определение просачивания биохимических маркеров

Образцы сыворотки крови мышей собирали через 8 ч после введения препарата Кон А, а в коцне периода инкубирования собирали надосадочную жидкость. Активность аланин аминотрансферазы (АЛТ) и лактат дегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови и надосадочной жидкости определяли с помощью стандартных аналитических наборов, доступных на рынке (Биоинженерный институт Нанкин Цзяньчэн, Нанкин, Китай). Исследования проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Определение супероксиддисмутазы (СОД), малондиальдегида (МДА), миелопероксидазы (МПО) и оксида азота (NO) в тканях печени.

Получали образцы печени, которые потом взвешивали и гомогенизировали на льду через 8 ч после приема Кон А. Исследования СОД, МДА, МПО и NO проводили с помощью аналитических наборов (Биоинженерный институт Нанкин Цзяньчэн, Нанкин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Белок определяли с помощью метода Лоури.

Скорость ингибирования (I) рассчитывали с помощью следующей формулы (уравнение 1), где V представляет полученные значения АСТ, ЛДГ, СОД, МДА, МПО и NO в контрольной группе, группе, получившей только Кон А, или группе, получившей Лаеннек, соответственно.

Ноябрь 2008[ОБ1] (1)


Поделиться с друзьями:

Наброски и зарисовки растений, плодов, цветов: Освоить конструктивное построение структуры дерева через зарисовки отдельных деревьев, группы деревьев...

История создания датчика движения: Первый прибор для обнаружения движения был изобретен немецким физиком Генрихом Герцем...

Таксономические единицы (категории) растений: Каждая система классификации состоит из определённых соподчиненных друг другу...

Семя – орган полового размножения и расселения растений: наружи у семян имеется плотный покров – кожура...



© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!

0.095 с.