Плазмиды бактерий. Классификация плазмид.

В настоящее время установлено, что все виды бактерий имеют не только кольцевые ДНК, но и плазмиды – двухцепочечный дополнительный генетический аппарат, обладающий свойством репликона.

-Размеры самой маленькой плазмиды 0,5х10(в 6) мДа. Наличие даннойплазмиды позволяет синтезировать 1-2 белка средних размеров.

- Крупные плазмиды 300-400 мДа.

Существует корреляция между размером плазмиды и числом копий: мелкиеплазмиды – многокопийный (от 10-60). Молекулярная масса плазмид не должна превышать молекулярную массу хромосом. В некоторых условиях, например, при аминокислотном голодании, происходит амплификация плазмид – репликация хромосомной ДНК не происходит, а происходит только репликация плазмид, пока их копийность не достигнет тысяч.

Могут ли бактерии существовать без плазмид? Существуют штаммы бактерий, которых не существует в природе, и только у них нет плазмид.

Плазмиды позволяют бактериям занимать определенные экологические ниши. Плазмиды делятся на:

1)Конъюгативные (трансмиссивные) – могут самостоятельно передаваться из одной бактериальной клетки в другую через контакт.

2)Неконъюгативные– не обладают данной способностью.

По фенотипическим признакам плазмиды делятся на:

1. R-плазмиды – (от англ слова устойчивость), позволяют выжить в присутствии антибиотиков. Могут быть как конъюгативные, так и неконъюгативные.

Устойчивость к пенициллину: под контролем генов, происходит синтез фермента В-лакталаза. При действии пенициллина, этот фермент выделяется наружу и инактивирует пенициллин.

2. Плазмидыбактериоциогении. Первая открытая плазмида из этого класса Cal-плазмида – на кончиках плазмиды происходит синтез колицина (белок, выделенный из E-coli). Этот белок удалял бактерии, которые не содержали данного белка (киллеры).

3. Ent-плазмиды. E-coli – условно патогенная бактерия. В 80-е годы была эпидемия у поросят. Выделили плазмиды E-coli. Под контролем данных плазмид происходит синтез энтероцептина – токсичного белка, вызывающего эпидемии.

4. Д-плазмиды (плазмиды биодеградации). К ним относятся крупныеплазмиды (300-450 мДа). В зависимости от того, какой ген отвечает за синтез того или иного вещества, их называют: Tol (толуол), Sal (салициловая кислота) и др. В 1974 году Чакрабати сконструировал штамм бактерий – пожирателей нефти. На плазмиде он поместил несколько генов, отвечающих за синтез тех или иных веществ, расщепляющих нефтяные продукты. Значение: охрана окружающей среды. Такой же подход Чакрабати использовал для борьбы с пестицидами.

5. Ti-плазмиды. Вызывают образование злокачественных опухолей у растений. Тоже крупные плазмиды. Находятся эти плазмиды в агробактериях. Через повреждения могут встраиваться в хромосому, и там начинается синтез гормонов роста, клетки начинают безудержно делиться, вызывая злокачественные опухоли.

Если вырезать такой Т-участок из плазмиды, то способность к образованию злокачественных опухолей удаляется, а способность проникать в растительную клетку остается. Данный метод используют для получения трансгенных растений (голубые розы).

6.Криптические плазмиды. Фенотипически никак не выражаются, их можно обнаружить лишь биохимически. Они очень мелкие.

7. Факторы переноса (F-плазмиды). Мол.масса = 64 мДа, размеры = 31 мкм.

Наличие этой плазмиды придает свойство донора. У них имеется tra-оперон (22-23 гена). 13 генов отвечает за синтез пили на поверхности бактерии. Пили необходимы для стабилизации конъюгирующих пар.

8. Hlay-плазмиды – разрушают эритроциты крови.

 

Тема 7. Генетический анализ у прокариот.

Основные способы обмена генетической информацией у бактерий.

Трансформация – процесс, при котором происходит передача генетической информации от донора к реципиентной клетке посредством ДНК.

Трансформация возможна у целого ряда бактерий: Diplococcus, Bacillus, у цианобактерий, актиномицетов и др.

Та клетка, из которой выделяется ДНК, называется донором, а другая – реципиентной клеткой.

Для проведения трансформации необходимы маркеры на селективных средах.

Для того, чтобы ДНК проникла в реципиентную клетку, реципиентные клетки должны находиться в состоянии компетентности, т.е. клеточные стенки должны быть готовы поглотить ДНК (образуются поры).

Этапы трансформации:

Выделение хромосомной ДНК

-ДНК должна быть высокомолекулярной, размером 10(в7) Д.

-ДНК должна быть двуцепочечной.

Компетентность возникает в середине логарифмической фазе роста. Образуются поры. Этому способствует фактор компетентности - белок, который вырабатывается в ходе роста культуры.

Различают следующие стадии:

А)Обратимая адсорбция. ДНК связывается с поверхностью реципиентной клетки. ДНК, связанная с реципиентными клетками, расщепляется специальными нуклеазами до фрагментов с молекулярной массой 5 х 10(в6) Д.

Б) Необратимая адсорбция. Фрагменты ДНК попадают внутрь клетки. Фрагменты менее 5х10(в5) в клетку не проникают.

-После попадания в бактерию двуцепочечная ДНК превращается в одноцепочечную: одна нить ДНК деградирует.

-На заключительной стадии происходит интеграция одноцепочечного фрагмента с ДНК клетки-реципиента.

Весь процесс трансформации завершается в течение 10-30 минут.

Высев на селективные среды.

Трансформанты:

-одиночные (селекция по одному маркеру).

-двойные (селекция сразу по двум маркерам, генам).

Частота появления двойных трансформантов очень низкая.