Пар стимулирует разбрасывание хромосом

Применение пара на момент образования мениска провоцирует эффективное разбрасывание хромосом. Пар ускоряет гидролиз клеточной стенки нагревом поверхности предметного стекла. Это стимулирует испарение этанола и увеличивает концентрацию уксусной кислоты для гидролиза целлюлозы. Более того, пар доставляет воду на поверхность предметного стекла, обеспечивая быструю регидратацию клетки. Claussen et al. Показал важную роль воды в набухании клеток млекопитающих (mammalian cell swelling). Kato et al. Также подчеркнул важность действия высокой влажности в целях разброса хромосом растений и поэтому предложил использовать камеры влажности при изготовлении препаратов. Мы предлагаем использовать пар для эффективного разброса хромосом. Мы полагаем что во время применения пара происходят три совпадающих процесса: (1) регидратация и набухание цитоплазмы; (2) быстрый гидролиз клеточной стенки, который помагает лопнуть клетке изза набухания цитоплазмы; (3) движение хромосом. Это очень важно, что пар применяется в момент зернистой поверхности, когда происходит формирование мениска. Давление мениска и пар создают быстрое набухание клетки и, как следствие, эффективный разброс хромосом.

 

Эффект относительной влажности

· Разброс хромосомы млекопитающих зависит от относительной влажности окружающей среды. Мы обнаружили, что RH значительно влияет на расброс хромосом. Оптимальная RH для подготовки хромосом растений, используя наш метод “SteamDrop” была 50-55%, аналогичным описанной для подготовки хромосом млекопитающих. Мы полагаем, что влияние RH на разброс хромосом определяется, главным образом, временем сушки предметного стекла и водно-индуцированным отеком цитоплазмы. При низкой RH происходит быстрое испарение этанола с увеличением концентрации уксусной кислоты (фиксатор не является азеотропной смесью) в результате происходит быстрая обработка цитоплазмы перед применением пара. При высокой RH, этанол этанол медленно испаряется, а процесс регидратации фиксатива идет быстро. Это приводит к низкой концентрации уксусной кислоты. Следовательно, недообработанная тонкая цитоплазма тормозит индуцирование паром хромосомное распределение. При средней относительной влажности, процессы регидратации фиксатива и испарения этанола сбалансированы. На момент применения пара плотность цитоплазмы достаточна для хромосомного распределения.

 

“SteamDrop” может вызвать растяжку хромосом

При действием паром на растительные хромосомы наблюдалось их растяжение. Было обнаружено что степень растяжения хромосом зависит от RH окружающей среды. Таким образом, хромосомы препарированы при умеренной влажности, в 1,42 раза длиннее, чем те, что препарированы при высокой RH. Claussen и др. показали изменения принудительноразбросанных хромосом на длине хромосом человеческого лейкоцита. Авторы доказали, что хромосомы имеют свой собственный потенциал к набуханию и предложили некоторые модификации белков хромосом поддерживающих разтяжку хромосом. Более того, было показано в реальном времени скан-силовой микроскопией (scan force microscopy) что молекулы ДНК могут деконденсировать и удлиняться под конкретные микро-экологические условия. Таким образом растяжение хромосомы может быть вызвано расслеблением самой себя ДНК или регидратации белков хроматина или обоими процессами. Claussen и др. предложили концепцию специфически регионального набухания белка. Они показали что ” G-образные области хромосомы” (G-banded chromosomal regions) учувствуют в растяжении хромосомы. Нерастянутые хромосомы человека не показывают каких-либо видимых GTG-образных участков. Воспроизведение G-banding участков на растительных хромосомах весьма трудно воспроизвести. Hliscs и др. предположили, что отсутствие растяжния хромосоы то, что вызывает отсутствие G-bands. Возможно, хромосомное растягивание произойдёт с протоколом “SteamDrop”, возможно он поможет получить воспроизводимые G-banding участки на хромосомах растений. Дальнейшие эксперименты будут проводится с целью проверки этого предположения.

 

 

Подведение итогов

Результаты, представленные здесь, демонстрируют эффективность метода “SteamDrop” в получении высоко качественных хромосомных препаратов видов растений с мелкими и крупными хромосомами. Применение препаратов хромосом для FISH и Tyramide-FISH было показано. Преимущества и отличия нашего “SteamDrop” метода от ранее разработанных методов это (1)применение пара вызывающее эффективное распределение хромосом; (2) минимизация промывки уменьшает повреждения хромосом и потери клеток; (3) вместо часто используемого капания на предметное стекло клеточной суспензии в этаноле-уксусной кислоте и фиксации мы предлагаем использовать клеточную суспензию. в 96% - ном этаноле, что позволяет регулировать распределение хромосом и количество цитоплазмы вокруг хромосом путем добавления фиксатора этанол-уксусной кислоты в правильном соотношении; (4)более того, долгосрочное хранение клеточной суспензии в 96% этаноле не отражается на качестве препарата хромосом; (5)несколько препаратов могут быть приготовлены из одного корня; (6)простейший протокол: подготовка суспензии клеток кроме остановки метафазы и ферментной обработки занимает всего 2-3 минуты; приготовление препарата хромосом – 1 минута.

 

 

Дополнения

 

Благодарности

Мы с благодарностью отмечаем поддержку Грант № 8112 от Министерства образования и науки Российской Федерации. Авторы выражают благодарность д. И. Шуберта за его критическое чтение рукописи и полезные обсуждения.

 

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.

 

Эта статья опубликована под лицензией бмц Лтд. Это открытый доступ к статье распространяются по условиям лицензии атрибуции, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии оригинала должным образом. В творческих публичных отказ преданность домен