Остановка метафазы, фиксация и обработка ферментами.

Для предварительной обработки и остановки метафазы смотри таблицу 1. После обработки, корни, побеги или пыльники с клетками материнской пыльцы (PMC) зафиксированы в 3:1 (этанол:уксусная кислота) на 30-50 минут при комнатной температуре. Клеточная суспензия была приготовлена strait away(не знаю как это) или источники клеток были накоплены ночью в морозилке при -20°С прошедшие обработку ферментами.

 

 

Таблица 1

Условия остановки метафазы и обработки ферментами

 

Виды	Реагенты и требования	Концентрация ферментов	Время выдержки в ферменте
Allium cepa, Allium fistulosum, Allium schoenoprasum, Allium altaicum	0.75 mM hydroxyurea for 20 h (RT), 0.05% colchicine for 3.5-4 h (RT)	0.6%	90–100 min
Humulus japonicus, Humulus lupulus, Linum usitatissimum, Cannabis sativa, Ricinus communis	2 mM 8-hydroxyquinoline, 4 h	0.6%	100–120 min
Triticale, Triticum aestivum, Thinopyrum ponticum, Thinopyrum elongatum	0.2% colchicine, 2 h1	1.2%	100–120 min
Brassica nigra, Brassica oleracea,	1-bromnaphtalene (1:1000 water solution) overnight 4°C	0.6%	90–100 min
Aloe vera,	1.2%	100–120 min
Rosa wichurana	0.3%	90–120 min
Anthurium andreanum, Monstera deliciosa, Philodendron scandens, Spathiphyllum wallisii, Syngonium auritum, Zantedeschia elliotiana, Hippophae rhamnoides, Festuca arundinacea and Lolium perenne	0.1%	60–90 min
Rosa wichurana 2	Mix of 0.1% colchicine and 2 mM 8-hydroxyquinoline (4 h, RT)3	1.2%	120–150 min
Allium wakegi, Allium roylei	Nitrous oxide gas (1.0 MPa), 3 h	0.6%	90–100 min
Allium cepa PMC	-	1.5%	180–200 min

 

¹the same treatment was used for shoot meristems of Triticale and Triticum aestivum.

²applied to shoot meristems.

³this procedure was carried out according to Ma et al., 1996 [30].

 

Запас смеси фермента, содержащего (w/v) 6% Пектолиаза Y-23 (Kikkoman, Tokyo, Japan), 6 % Целюлаза Onozuka R-10 (Yakult Co. Ltd., Tokyo, Japan) и 6% Цитогеликаза (Sigma-Aldish Co.LLC, France), приготовлены в 0.1 М цитрусовый буфер (citric buffer) (pH4.8). Концентрация действующей смеси фермента и время содержания в них для разных видов приведены в таблице1.

 

Протокол препарирования хромосом, использующий метод “SteamDrop”.

Обработка ферментами

 

1. Промыть корни (пыльников или побегов) в воде в течение 10-30 мин

 

2. Расчленить меристемы и перенести их в 0.1М цитрусовый буфер (citric buffer), pH 4.8

 

3. Перенести 1-5 меристем в 0.5 мл пробирки с 20-30 μl смеси фермента (Таблица 1)

 

4. Содержать в 37 °С для 1-2.5 часов, в зависимости от вида (Таблица 1)

 

 

Приготовление клеточной суспензии

 

1. Воронка/вода/прокрутить в водовороте (Vortex) пробирки с обработанной меристемой для получения суспензии

 

2. Добавить 600 μl дистиллированной воды и смешать

 

3. Подвергнуть центрифуге на 10,000 rpm на 45 секунд

 

4. Удалить надосадочную жидкость используя пипетку Пастера

 

5. Добавить 600 μl 96% этанола и смешать (клеточная суспензия может хранится при -20°С по крайней мере 6 месяцев)

 

6. Подвергнуть центрифуге на 11,000 rpm на 30 секунд

 

7. Удалить надосадочную жидкость перевернув пробирку

 

8. Ресуспензировать (перерастворить, гомогенизировать) гранулу (pellet) в 20-100 μl 96% этанола, в зависимости от концентрации клеток.

 

Препарирование хромосом

1. Капнуть 10 μl клеточной суспензии на предметное стекло* и ждать, пока поверхнасть не станет гранулированной (зернистой), т.е. мениск этанола прошёл в центр клеток, (10-15 секунд) (мениск- искривление жидкости вследствие соприкосновения с поверхностью)

 

2. Капнуть 18-22 μl фиксатора (1:1, 2:1, 3:1 или 5:1 этанол:уксусная кислота)** и ждать пока поверхность не станет зернистой и слой фиксатора не утоньчится (25-35 секунд)

 

3. Положить стёкла вверх ногами под пар от водяной бани на 55°С (10-15 см от поверхности воды водяной бани) на 3-5 секунд

 

4. Для удвоения “SeteamDrop”, повторить шаг 2 но с меньшим объёмом (3-6 μl) фиксатора и повышенной концентрацией уксосной кислоты. Выполнить шаг 3 только в течение 1 секунды.

 

5. Немедленно высушить стёкла сухим воздухом (таким как от настольного вентилятора).

 

 

Пометки

 

* - для препарирования крупных хромосом используется поверхность стёклышка с APES (3-аминопропил-триэтокси-силан) для предотвращения частичной отслойки хромосом. APES покрывает стёклышки: 1.5% APES в 100% ацетоне на 30 секунд, дважды промыть в дистиллированной воде и сушить 1 час на 37°С.

 

** - Протокол позволяет легко скорректировать результаты обработки ферментами – проверяется уровень ферментативной обработки ткани в первом препарате хромосом под микроскопом, если ткань при обработке стала сильно переваренная– использовала высокую пропорцию уксусной кислоты в фиксаторе (1:1 или 2:1); если обработанная ткань менее “переваренная” – маленькая пропорция уксусной кислоты в фиксаторе (5:1 Или 10:1). (речь о степени обработанности, скорее всего это видно невооружённым глазом под микроскопом).

 

 

Подготовка проб Probe preparation

LFS and bulb alliinase gene fragment (не знаю что это, связанно с генами лука)

The LFS and bulb alliinase gene пробы фрагментов были получены с использованием специфических праймеров (для LFS: LFSbeF: 5′-AAATGGAGCTAAATCCTGGTG-3′, LFSbeR: 5′-CATAATGCATCACAGCACTGAA-3′; для alliinase: Allbe1F: 5′-GGTCATCTCCCTTTCACCAA-3′, Allbe1R: 5′-TGATCAAACTCAAACGCAC-3′) разработано программным обеспечением Primer 3.0 (http://bioinfo.ebc.ee/primer3-0.4.0/) используя LFS [GenBank: AB094593.1] и alliinase [GenBank: L48614] последовательности из GenBank в NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). ПЦР условия были 94°С – 1 минута, 35 циклов; 94°С – 1 минута; 58°С – 1 минута; 72°C – 1 минута; окончательное растяжение (final elongation): 72°С – 3 минуты. Продукты ПЦР были клонированы с помощью pPCR-TOPO инструмеетов (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) согласно описанию производителя (какой-то стандарт). Плазмидная ДНК была выделена из белых колоний, секвенированна и секвенировалась с помощью BLASTN (программа для секвенирования). Плазмиды высокой схожестью с LFS или с bulb alliinase генетическими фрагментами были отобраны для маркировки с Biotin Nick Translation Mix (смесь Биотина Ника транслятора) (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany).

 

 

S rDNA

Плазмиды несущие 5S rRNA ген ржи (pScT7, [31] промаркирован с помощью Biotin-16-dUTP с Biotin- Nick Translation Mix согласно описанию производителя (какой-то стандарт) (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany).

 

(AAC)5 олигонуклеотид

(AAC)5 олигонуклеотид промаркерован биотином в 3’- и 5’ –концах синтезированных в ZAO ‘Syntol’ (Moscow, Russia).

 

Выделение ДНК

Геномная ДНК была выделена согласно Роджерса и Bendich. ()

 

Tyramide-FISH

Пробы гибридизации и обнаружение сигнала было сделано согласно Khrustaleva и Kik с незначительными изменениями. После RNAse обработки и шага денатурации, предметные стекла были зафиксированы в 4% параформальдегидном буфере в 1 × PBS (10 × PBS: 1.3 M NaCl, 70 mM Na₂HPO₄, 30 mM NaH₂PO₄, pH 7.5) на 8 минут и 10 минут, соответственно. Шаг инактивации эндогенной пероксидазы был проведён выставлением предметных стекол в 0.01М HCl на 8 минут. Смесь гибридизайии (hybridization mixture) состояла из 50% (v/v) деионизированном формамиде, 10% (w/v) декстран сульфате, 2 х SSC, 0.25% додецилсульфате натрия, 2.75 ± 1.00 ng/μl проб ДНК. Смесь подверглась денатурации на 75°С на 5 минут и впоследствии размещена на лёд на 5 минут. 60 микролитров (microliters) смеси были добавлены к препаратам хромосом, покрыв их плёнкой (22 × 32 mm) и денатурировалось всё 5 минут на 80°С. 82% строгого промывания было применено: стёкла были промыты в 2 х SSC дважды по 5 минут на 37°С, в 25% (v/v) формамиде в 0.4. х SSC дважды по 10 минут на 42°С, В то время как в 2 х SSC на 3 минуты при 37°С. Обнаружение растворения тирамида было приготовлено тчательным перемешиванием в 1:50 маточного раствора Тирамида в сильном растворителе (Perkin Elmer, Inc., Waltham, Massachusetts, USA) с 10ю% (w/v) декстран сульфате (dextran sulfate.)

 

FISH

Процедура FISH с 5S rDNA и биотинилированным (ААС)5 в качестве пробы была проведена согласно протоколу Хеслопа-Харисона и др. и Счмидта и др. с небольшим изменением приготовления предметных стекол (или препаратов slide preatreatment) до добавления смеси гибридизации (hybridization mix.) Дополнительная обработка с 4% буферным раствором параформальдегида (BPS), pH 8.0, на 9 минут до обработки RNA с использованием пепсина и пепсин исключался.

 

 

Микроскопирование и исследование изображения

 

Предметные стёкла были изучены под микроскопом Zeiss Axio (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany). Отобранные изображения были сфотографированы с помощью Axio Cam MRm камеры. Обработка изображений производилась с помощью программного обеспечения AxioVision ver.4.6 (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany). Итоговая картинка оптимизировалась в фотошопе (Adobe Inc., San Jose, California, USA).

 

 

Результаты