Простой метод “SteamDrop” для высококачественного препарирования хромосом.

Растительный материал

Корневые меристематические клетки добытые из всходов: Лук посевной (Allium cepa) (2n = 2 x = 16; размер хромосом), Лук-батун (A. fistulosum) (2n = 2 × =16), Лук скорода (A. Schoenoprasum) (2n = 2 × =16), Лук алтайский (A. Altaicum) (2n = 2 × =16), Лён (Linum usitatissimum) (2n = 2 × =16), Пшеница мягкая (Triticum aestivum) (2n = 6 × =42), Конопля посевная (Cannabis sativa) (2n = 2 × =20).

 

Корневые меристематические клетки были обнаружены в интенсивно росших растениях в теплице: Лук из Гималаев (Allium roylei) (2n = 2 × =16), Лук из Кореи (A. Wakegi) (2n = 2 × =16), Хмель японский (Humulus japonicas) (2n = 2 × =17 for male or 2n = 2 × =16 for female plants), Хмель обыкновенный (H. Lupulus) (2n = 2 × =20), Роза Вихуры (Rosa wichurana) (2n = 2 × =14), Тополь чёрный (Populus nigra) (2n = 2 × =38), Капуста огородная (Brassica oleracea) (2n = 4 × =36), Клещевина обыкновенная (Ricinus communis) (2n = 2 × =20), Антриум Андре (Anthurium andreanum) (2n = 2 × =30), Монстера деликатесная (Monstera deliciosa) (2n = 4 × =60), Филодендрон цепляющийся (Philodendron scandens) (2n = 2 × =32), Спатифиллум Уоллиса (Spathiphyllum wallisii) (2n = 2 × =30), Сингониум ушковатый (Syngonium auritum) (2n = 2 × =24), Калла элилота (Zantedeschia elliotiana) (2n = 2 × =32), Алое вера (Aloe vera) (2n = 2 × =14), Облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides) (2n = 2 × =24), Овсяница тростниковая (Festuca arundinacea) (2n = 6 × =42) и Плевел многолетний (Lolium perenne) (2n = 2 × =14), Thinopyrum ponticum (2n = 10 × =70), Th. elongatum (2n = 2 × =14).

 

Меристемы побегов собираются из проростков Пшеницы мягкой Triticum aestivum и Тритикале (2n = 6 x = 42) или от тепличных растений Розы Вихуры Rosa wichurana также использованные в качестве источника делящихся клеток для препарирования хромосом.

Остановка метафазы, фиксация и обработка ферментами.

Для предварительной обработки и остановки метафазы смотри таблицу 1. После обработки, корни, побеги или пыльники с клетками материнской пыльцы (PMC) зафиксированы в 3:1 (этанол:уксусная кислота) на 30-50 минут при комнатной температуре. Клеточная суспензия была приготовлена strait away(не знаю как это) или источники клеток были накоплены ночью в морозилке при -20°С прошедшие обработку ферментами.

 

 

Таблица 1

Условия остановки метафазы и обработки ферментами

 

Виды	Реагенты и требования	Концентрация ферментов	Время выдержки в ферменте
Allium cepa, Allium fistulosum, Allium schoenoprasum, Allium altaicum	0.75 mM hydroxyurea for 20 h (RT), 0.05% colchicine for 3.5-4 h (RT)	0.6%	90–100 min
Humulus japonicus, Humulus lupulus, Linum usitatissimum, Cannabis sativa, Ricinus communis	2 mM 8-hydroxyquinoline, 4 h	0.6%	100–120 min
Triticale, Triticum aestivum, Thinopyrum ponticum, Thinopyrum elongatum	0.2% colchicine, 2 h1	1.2%	100–120 min
Brassica nigra, Brassica oleracea,	1-bromnaphtalene (1:1000 water solution) overnight 4°C	0.6%	90–100 min
Aloe vera,	1.2%	100–120 min
Rosa wichurana	0.3%	90–120 min
Anthurium andreanum, Monstera deliciosa, Philodendron scandens, Spathiphyllum wallisii, Syngonium auritum, Zantedeschia elliotiana, Hippophae rhamnoides, Festuca arundinacea and Lolium perenne	0.1%	60–90 min
Rosa wichurana 2	Mix of 0.1% colchicine and 2 mM 8-hydroxyquinoline (4 h, RT)3	1.2%	120–150 min
Allium wakegi, Allium roylei	Nitrous oxide gas (1.0 MPa), 3 h	0.6%	90–100 min
Allium cepa PMC	-	1.5%	180–200 min

 

¹the same treatment was used for shoot meristems of Triticale and Triticum aestivum.

²applied to shoot meristems.

³this procedure was carried out according to Ma et al., 1996 [30].

 

Запас смеси фермента, содержащего (w/v) 6% Пектолиаза Y-23 (Kikkoman, Tokyo, Japan), 6 % Целюлаза Onozuka R-10 (Yakult Co. Ltd., Tokyo, Japan) и 6% Цитогеликаза (Sigma-Aldish Co.LLC, France), приготовлены в 0.1 М цитрусовый буфер (citric buffer) (pH4.8). Концентрация действующей смеси фермента и время содержания в них для разных видов приведены в таблице1.

 

Протокол препарирования хромосом, использующий метод “SteamDrop”.

Обработка ферментами

 

1. Промыть корни (пыльников или побегов) в воде в течение 10-30 мин

 

2. Расчленить меристемы и перенести их в 0.1М цитрусовый буфер (citric buffer), pH 4.8

 

3. Перенести 1-5 меристем в 0.5 мл пробирки с 20-30 μl смеси фермента (Таблица 1)

 

4. Содержать в 37 °С для 1-2.5 часов, в зависимости от вида (Таблица 1)

 

 

Препарирование хромосом

1. Капнуть 10 μl клеточной суспензии на предметное стекло* и ждать, пока поверхнасть не станет гранулированной (зернистой), т.е. мениск этанола прошёл в центр клеток, (10-15 секунд) (мениск- искривление жидкости вследствие соприкосновения с поверхностью)

 

2. Капнуть 18-22 μl фиксатора (1:1, 2:1, 3:1 или 5:1 этанол:уксусная кислота)** и ждать пока поверхность не станет зернистой и слой фиксатора не утоньчится (25-35 секунд)

 

3. Положить стёкла вверх ногами под пар от водяной бани на 55°С (10-15 см от поверхности воды водяной бани) на 3-5 секунд

 

4. Для удвоения “SeteamDrop”, повторить шаг 2 но с меньшим объёмом (3-6 μl) фиксатора и повышенной концентрацией уксосной кислоты. Выполнить шаг 3 только в течение 1 секунды.

 

5. Немедленно высушить стёкла сухим воздухом (таким как от настольного вентилятора).

 

 

Пометки

 

* - для препарирования крупных хромосом используется поверхность стёклышка с APES (3-аминопропил-триэтокси-силан) для предотвращения частичной отслойки хромосом. APES покрывает стёклышки: 1.5% APES в 100% ацетоне на 30 секунд, дважды промыть в дистиллированной воде и сушить 1 час на 37°С.

 

** - Протокол позволяет легко скорректировать результаты обработки ферментами – проверяется уровень ферментативной обработки ткани в первом препарате хромосом под микроскопом, если ткань при обработке стала сильно переваренная– использовала высокую пропорцию уксусной кислоты в фиксаторе (1:1 или 2:1); если обработанная ткань менее “переваренная” – маленькая пропорция уксусной кислоты в фиксаторе (5:1 Или 10:1). (речь о степени обработанности, скорее всего это видно невооружённым глазом под микроскопом).

 

 

Подготовка проб Probe preparation

LFS and bulb alliinase gene fragment (не знаю что это, связанно с генами лука)

The LFS and bulb alliinase gene пробы фрагментов были получены с использованием специфических праймеров (для LFS: LFSbeF: 5′-AAATGGAGCTAAATCCTGGTG-3′, LFSbeR: 5′-CATAATGCATCACAGCACTGAA-3′; для alliinase: Allbe1F: 5′-GGTCATCTCCCTTTCACCAA-3′, Allbe1R: 5′-TGATCAAACTCAAACGCAC-3′) разработано программным обеспечением Primer 3.0 (http://bioinfo.ebc.ee/primer3-0.4.0/) используя LFS [GenBank: AB094593.1] и alliinase [GenBank: L48614] последовательности из GenBank в NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). ПЦР условия были 94°С – 1 минута, 35 циклов; 94°С – 1 минута; 58°С – 1 минута; 72°C – 1 минута; окончательное растяжение (final elongation): 72°С – 3 минуты. Продукты ПЦР были клонированы с помощью pPCR-TOPO инструмеетов (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) согласно описанию производителя (какой-то стандарт). Плазмидная ДНК была выделена из белых колоний, секвенированна и секвенировалась с помощью BLASTN (программа для секвенирования). Плазмиды высокой схожестью с LFS или с bulb alliinase генетическими фрагментами были отобраны для маркировки с Biotin Nick Translation Mix (смесь Биотина Ника транслятора) (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany).

 

 

S rDNA

Плазмиды несущие 5S rRNA ген ржи (pScT7, [31] промаркирован с помощью Biotin-16-dUTP с Biotin- Nick Translation Mix согласно описанию производителя (какой-то стандарт) (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany).

 

(AAC)5 олигонуклеотид

(AAC)5 олигонуклеотид промаркерован биотином в 3’- и 5’ –концах синтезированных в ZAO ‘Syntol’ (Moscow, Russia).

 

Выделение ДНК

Геномная ДНК была выделена согласно Роджерса и Bendich. ()

 

Tyramide-FISH

Пробы гибридизации и обнаружение сигнала было сделано согласно Khrustaleva и Kik с незначительными изменениями. После RNAse обработки и шага денатурации, предметные стекла были зафиксированы в 4% параформальдегидном буфере в 1 × PBS (10 × PBS: 1.3 M NaCl, 70 mM Na₂HPO₄, 30 mM NaH₂PO₄, pH 7.5) на 8 минут и 10 минут, соответственно. Шаг инактивации эндогенной пероксидазы был проведён выставлением предметных стекол в 0.01М HCl на 8 минут. Смесь гибридизайии (hybridization mixture) состояла из 50% (v/v) деионизированном формамиде, 10% (w/v) декстран сульфате, 2 х SSC, 0.25% додецилсульфате натрия, 2.75 ± 1.00 ng/μl проб ДНК. Смесь подверглась денатурации на 75°С на 5 минут и впоследствии размещена на лёд на 5 минут. 60 микролитров (microliters) смеси были добавлены к препаратам хромосом, покрыв их плёнкой (22 × 32 mm) и денатурировалось всё 5 минут на 80°С. 82% строгого промывания было применено: стёкла были промыты в 2 х SSC дважды по 5 минут на 37°С, в 25% (v/v) формамиде в 0.4. х SSC дважды по 10 минут на 42°С, В то время как в 2 х SSC на 3 минуты при 37°С. Обнаружение растворения тирамида было приготовлено тчательным перемешиванием в 1:50 маточного раствора Тирамида в сильном растворителе (Perkin Elmer, Inc., Waltham, Massachusetts, USA) с 10ю% (w/v) декстран сульфате (dextran sulfate.)

 

FISH

Процедура FISH с 5S rDNA и биотинилированным (ААС)5 в качестве пробы была проведена согласно протоколу Хеслопа-Харисона и др. и Счмидта и др. с небольшим изменением приготовления предметных стекол (или препаратов slide preatreatment) до добавления смеси гибридизации (hybridization mix.) Дополнительная обработка с 4% буферным раствором параформальдегида (BPS), pH 8.0, на 9 минут до обработки RNA с использованием пепсина и пепсин исключался.

 

 

Микроскопирование и исследование изображения

 

Предметные стёкла были изучены под микроскопом Zeiss Axio (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany). Отобранные изображения были сфотографированы с помощью Axio Cam MRm камеры. Обработка изображений производилась с помощью программного обеспечения AxioVision ver.4.6 (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany). Итоговая картинка оптимизировалась в фотошопе (Adobe Inc., San Jose, California, USA).

 

 

Результаты

 

Подведение итогов

Результаты, представленные здесь, демонстрируют эффективность метода “SteamDrop” в получении высоко качественных хромосомных препаратов видов растений с мелкими и крупными хромосомами. Применение препаратов хромосом для FISH и Tyramide-FISH было показано. Преимущества и отличия нашего “SteamDrop” метода от ранее разработанных методов это (1)применение пара вызывающее эффективное распределение хромосом; (2) минимизация промывки уменьшает повреждения хромосом и потери клеток; (3) вместо часто используемого капания на предметное стекло клеточной суспензии в этаноле-уксусной кислоте и фиксации мы предлагаем использовать клеточную суспензию. в 96% - ном этаноле, что позволяет регулировать распределение хромосом и количество цитоплазмы вокруг хромосом путем добавления фиксатора этанол-уксусной кислоты в правильном соотношении; (4)более того, долгосрочное хранение клеточной суспензии в 96% этаноле не отражается на качестве препарата хромосом; (5)несколько препаратов могут быть приготовлены из одного корня; (6)простейший протокол: подготовка суспензии клеток кроме остановки метафазы и ферментной обработки занимает всего 2-3 минуты; приготовление препарата хромосом – 1 минута.

 

 

Дополнения

 

Благодарности

Мы с благодарностью отмечаем поддержку Грант № 8112 от Министерства образования и науки Российской Федерации. Авторы выражают благодарность д. И. Шуберта за его критическое чтение рукописи и полезные обсуждения.

 

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.

 

Эта статья опубликована под лицензией бмц Лтд. Это открытый доступ к статье распространяются по условиям лицензии атрибуции, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии оригинала должным образом. В творческих публичных отказ преданность домен

Простой метод “SteamDrop” для высококачественного препарирования хромосом.

Илья Киров, Михаил Дивашук, Катрин Ван Лир, Александр Соловьёв и Людмила Крусталёва.

 

В общем

 

Поверхностные представления

Препарирование хромосом это решающий шаг в получении удовлетворительных результатов в молекулярно цитогенетических исследованиях. Подготовка хромосом растений для молекулярно цитогенетических целей становится сложной для некоторых видов. В отличие от препарирования человеческих хромосом, процесс протекающий во время препарирования хромосом растений и вызывающий разброс хромосом до сих пор недостаточно изучен (речь о препаратах с хромосомами).

 

Результаты

 

Мы изучили движущие силы распространения растительных хромосом после нанесения клеточной суспензии на предметное стекло (речь возможно о давленных препаратах хоромосом). Мы наблюдали стимуляцию паром (steam) цитоплазматического гидролиза и быстрое припарирование хромосом и что хромосомы растягиваются во время этого хромосомного препарирования. Основываясь на этих наблюдениях, мы разработали новый метод, названный “SteamDrop”, для приготовления хорошо разбросанных митотических и пахитенных хромосом и успешно опробовали его на 28 видов растений с большими и маленькими хромосомами. Мы использовали клеточные суспензии вместо этанола из распространённого фиксатора этанолацетической кислоты. Митотический и мейотический хромосомные препараты с помощью “SteamDrop” были использованы в экспериментах в флуоресцентной гибридизации “in situ” (FISH) с повторяющимеся и уникальными пробами ДНК. Длительное хранение клеточной суспензии в этаноле не ухудшало качество хромосомных препаратов.

 

Заключение

 

Метод “SteamDrop” обеспечивает трудный и рутинный метод для высоко качественных препаратов хромосм. Метод может быть применён для метафазных и пахитенных препаратов хромосом в широком диапазоне видов (растений). Препараты, приготовленные с помощью “SteamDrop” хорошо подходят для повторяющихся и уникальных ДНК визуализаций (для просмотра ДНК).

 

Ключевые слова. (для поиска в интернете, видимо)

Препарирование хромосом растений – флюарисценция in situ

Гибридизация – Применение корня – Новый метод

 

 

Что уже есть по этой теме

 

Препарирование хромосом это ключ ко всем методам цитогенетики. Большинство современных молекулярных цитогенетических методов таких как FISH, GISH и Tyramide-FISH требуют хорошо распределённых и морфологически не нарушенных (цельных) хромосом. Несколько отчётов было посвящено разъяснению динамики хромосомного препарирования для улучшения препарирования человеческих хромосом, в то время, как числа(колличества) исследований весьма не хватает для растений. Трудности в получении хорошо распределённых растительных хромосом (речь о препаратах, возможно и давленных) также связанны с клеточной стенкой. Более того, из-за большого разнообразия видов имеющих мелкие или крупные хромосомы, маленькое или большое количество хромосом и различные соединения в их цитоплазме (видимо речь о том, что одна хромосома может перекрывать другую), множество исследований по модификации хорошего метода препарирования хромосом проведено. Это три главных метода препарирования растительных хромосом:

 

Давление(давить препарат), равномерное растекание (spreading) и нанесение капли (dropping, я полагаю, что это капля). Метод давления (давленый) является распространённым для подсчёта хромосом в цитогенетике растений уже десятилетия. Противоположный воздушно сухой/равномерного растекания метод включающий приготовление клеточной суспензии это немедленное нанесение на предметное стекло с помощью мацерации (размачивания) с кончика игры (шприца, возможно) и распределение по предметному стеклу. Этот метод наиболее подходит для растений с мелкими хромосомами. Модификация метода Пижнекера и Фервёрда был разработан Фукуей и Илижимой (или Илийимой) для препарирования хромосом риса. Воздушно сухой/равномерного растекания метод разработан также для изучения соматических хромосом кукурузы (маиса). Метод капли (drop) был разработан для человеческих клеток более чем половину столетия назад. С тех пор многие улучшения метода и обширные исследования всех влияющих параметров, движение в растекании человеческой хромосомы было завершено (видимо удалось сделать “растекающий” препарат). Впервые на растительных хромосомах метод капли был применён для изолированных протопластов. Этот метод имел некоторые минусы, такие как: I маленький митотический индекс по причине потери клеток во время изоляции протопласта и повреждение метофазного протопласта при гипотонической обработки (я хз что это), II вызванная случайным слиянием изолированных протопластов полиплоидия, III постоянный труд над протоколом, IV образование протопластов из неповреждённых растительных тканей более сложно чем из культивируемых клеток. Като и другие разработали новый воздушно сухой метод капли, который основывается на ферментативно обработанных корневых меристемах и приготавлении клеточной суспензии в пробирке. Клеточная суспензия последовательно промывалась в воде, 100% этаноле и уксусной кислоте/этаноле (9:1), капля наносилась на стёклышки в ровной коробке с сухими бумажными полотенцами и медленно высыхала. Данный метод успешно применен для FISH на митотической метафазе (mitotic metaphase так написано) и пахитенных хромосомах кукурузы (маиса) и митотической метафазе хромосом соевых бобов. Однако, применение этого метода для видов с крупными хромосомами остаётся проблематичным, потомучто мало число неперекрытых метафаз (вероятно, имеется в виду, что их чаще не видно).

Досаждает множество протоколов, доступных для препарирования растительных хромосом, и как правило не надёжных для применения, несмотря на это был разработан применимый и надёжный.

Поэтому с помощью изучения всех этапов препарирования хромосом в деталях, мы разработали простой протокол “SteamDrop” для достоверного препарирования хромосом из митотических и мейотических растительных хромосом. Ключевой шаг в подготовке хорошо распространнёных хромосом (всех в отдельности видно) это применение пара (steam) в момент образования мениска на клетке вовремя испарения фиксатора. Применение “SteamDrop”-препарированных хромосом для FISH картирования (FISH mapping) или повторения ДНК, а также демонстрации индивидуальных генов. Препарирование хромосом дозволило физическое картирование маленьких фрагментов ДНК луковых генов используя Tyramide-FISH. Метод “SteamDrop” применялся на 28 видах с разным размером и числом хромосом, принадлежащим 13-и однодольным (20 видов) и 7-и двудольным (8 видов) классам.

 

 

Методы

 

Растительный материал

Корневые меристематические клетки добытые из всходов: Лук посевной (Allium cepa) (2n = 2 x = 16; размер хромосом), Лук-батун (A. fistulosum) (2n = 2 × =16), Лук скорода (A. Schoenoprasum) (2n = 2 × =16), Лук алтайский (A. Altaicum) (2n = 2 × =16), Лён (Linum usitatissimum) (2n = 2 × =16), Пшеница мягкая (Triticum aestivum) (2n = 6 × =42), Конопля посевная (Cannabis sativa) (2n = 2 × =20).

 

Корневые меристематические клетки были обнаружены в интенсивно росших растениях в теплице: Лук из Гималаев (Allium roylei) (2n = 2 × =16), Лук из Кореи (A. Wakegi) (2n = 2 × =16), Хмель японский (Humulus japonicas) (2n = 2 × =17 for male or 2n = 2 × =16 for female plants), Хмель обыкновенный (H. Lupulus) (2n = 2 × =20), Роза Вихуры (Rosa wichurana) (2n = 2 × =14), Тополь чёрный (Populus nigra) (2n = 2 × =38), Капуста огородная (Brassica oleracea) (2n = 4 × =36), Клещевина обыкновенная (Ricinus communis) (2n = 2 × =20), Антриум Андре (Anthurium andreanum) (2n = 2 × =30), Монстера деликатесная (Monstera deliciosa) (2n = 4 × =60), Филодендрон цепляющийся (Philodendron scandens) (2n = 2 × =32), Спатифиллум Уоллиса (Spathiphyllum wallisii) (2n = 2 × =30), Сингониум ушковатый (Syngonium auritum) (2n = 2 × =24), Калла элилота (Zantedeschia elliotiana) (2n = 2 × =32), Алое вера (Aloe vera) (2n = 2 × =14), Облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides) (2n = 2 × =24), Овсяница тростниковая (Festuca arundinacea) (2n = 6 × =42) и Плевел многолетний (Lolium perenne) (2n = 2 × =14), Thinopyrum ponticum (2n = 10 × =70), Th. elongatum (2n = 2 × =14).

 

Меристемы побегов собираются из проростков Пшеницы мягкой Triticum aestivum и Тритикале (2n = 6 x = 42) или от тепличных растений Розы Вихуры Rosa wichurana также использованные в качестве источника делящихся клеток для препарирования хромосом.