Эффект относительной влажности на распределение хромосом и их длину.

Оценка эффекта относительной влажности на хромосомное растекание была использована при различной RH (25-30%, 50-55% и 65-70%) при комнатной температуре (22–25°C). Лук посевной был использован для этого эксперимента. Корректировка RH в изолированной комнате-ящике была выполнена вручную. RH отмерялась гидрометром Testo 625 (Testo AG, Lenzkirch, Germany).

Микрокопирование показало что при умеренной RH (50-55%) распределение хромосом проходило на протяжении всего периода воздействия пара, в результате до 60% хромосомы распределяются без цитоплазмы. При высокой RH (65-70%) в большинстве случаев хромосомы слипаются, не растекаясь после воздействия пара и цитоплазматический гидролиз часто не завершён. Приготовление при низкой RH (25-30%) приводит к раннему цитоплазматическому гидролизу, что предотвращает распределение хромосом.

Общая длина хромосомы была измерена на предметных стёклах приготовленных при умеренной или высокой RH, используя одну пробу клеточной суспензии. Хромосомы, приготовленные при высокой влажности были гораздо мельче (163 ± 14 μm) чем хромосомы, приготовленные при умеренной влажности (232 ± 1.0 μm, P ≤ 0.0001). При высокой RH общий размер длины хромосомы имел широкий диапазон, в то время как при умеренной RH он был однообразен. Приготовление хромосом при высокой влажности проявились как яркосветлые структуры высокой оптической плотности под фазо-контрастной микроскопией, в то время как хромосомы, приготовленные при умеренной RH теряли в конденсации света и проявились как серые структуры (Фигура 3).

Фигура 3 Метафазные хромосомы Лука посевного, приготовленные при умеренной (50%) RH (левые) и высокой (70%) RH (правые). Bar = 10 μm.

Распределение хромосом методом “SteamDrop”

У видов с мелкими хромосомами большинство метафазных клеток препарировались методом “SteamDrop” показывающим хорошее хромосомное распределение (<2 перекрытых хромосом, Фигура 4 Конопля посевная, Хмель японский, Капуста огородная, Роза Вихура). У видов с крупными хромосомами только 15-20% метафаз появилось хорошо разбросанными. Поэтому, для этих видов была использована вторая капля фиксатора с повышенной концентрацией уксусной кислоты (например 1:1 или ледяная уксусная кислота) после первой капли 5:1 или 3:1 этанол:уксусной кислоты (Фигура 4 Лук посевной, Лук-батун, Тритикале, Пшеница мягкая). Вторая капля содержащая высокую порцию уксусной кислоты завершила обработку цитоплазмы и предоставила дополнительный разброс хромосом до иммобилизации хромосом (создания неподвижности) на поверхности предметного стекла. Пар применяется после каждой капли фиксатора. Микроскопирование распределившихся хромосом показало, что использование двух капель фиксатора продлило время распределения хромосом. Использование второй капли фиксатора в луке (onion) увеличило число хорошо разбросанных метафаз в два раза, по сравнению с одной каплей. Должно быть упомянуто что применение газа закиси азота как остановителя метафазы в комбинации со второй каплей фиксатора увеличивает число хорошо расбросанных метафаз до 60% у видов Лука. Применение второй капли в видах с мелкими хромосомами (Cannabis sativa, Humulus japonicus, Humulus lupulus, Linum. usitatissimum, Populus nigra, Brassica oleracea, Ricinus communis) дало высокий процент перекрытых метафаз и потерянных хромосом, по сравнению с использованием одной капли. Однако это не так для Розы Вихуры, Spathiphyllum wallisii, Syngonium auritum, Zantedeschia elliotiana. Эти виды также имеют мелкие хромосомы, но устойчивая клеточная стенка и применение второй капли даёт хорошо распределённые хромосомы с полностью обработанной цитоплазмой.

Фигура 4 Метафазные пластинки видов с крупными хромосомами (Allium cepa, Allium fistulosum, Triticale, Triticum aestivum) и мелкими (Cannabis sativa, Humulus japonicus, Brassica oleracea, Rosa wichurana). Последняя фигура это пахитенные хромосомы Лука посевного. Все фотографии были сделаны с некоторыми модификациями. Bar = 10 μm.

Применение второй капли также успешно для мейотических препаратов хромосом с высокой концентрацией ферментов (1.5% целлюлаза, 1.5% пектолиаза, 1.5% цитогеликаза) на 3 часа и с высокой концентрацией уксусной кислоты в фиксаторе (1:1) для первой капли и 100% уксусная кислота для второй капли (Фигура 4. Лук посевной).