Генетические методы исследования вируса гепатита С

 

Внедрение в лабораторную практику ПЦР предоставило возможность использовать прямой лабораторный метод для непосредственного обнаружения генома возбудителя из небольшого количества легкодоступного биологического материала, позволяя определять РНК ВГС в детектируемых количествах через 1-3 недели после инфицирования [3, 42].

Сравнение первичной структуры 5'-NTR-области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость. Это сделало предпочтительными использование праймеров из данной зоны РНК в диагностических тест-системах [12, 14].

Первый стандартизированный набор для определения РНК ВГС («Amplicor TM HCV», «Roche Diagnostic Systems», Швейцария) изготовлен в 1993 г., он позволял выявлять 100 и более копий/мл. Дальнейшему развитию эффективности методики способствовало введение внутреннего контроля с этапа пробоподготовки в диагностические наборы реагентов [43, 44]. В настоящее время чувствительность коммерческих тест-систем составляет 10-50 копий РНК в 1 мл крови (50-100 международных единиц (МЕ) /мл).

Международным стандартом ВОЗ 96/790 для количественного определения вирусного генома является образец плазмы крови в лиофилизированном виде, содержащий РНК ВГС 1-го генотипа в концентрации 105 МЕ/мл [45]. В настоящее время результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК, содержащихся в 1 мл, в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Специальные коэффициенты позволяют пересчитывать полученные показатели концентрации в международные единицы. В большинстве коммерческих тест-системах для проведения анализа используется сыворотка и/или плазма крови пациента c гепатита С. При этом имеются данные, что тестирование образцов сыворотки/плазмы крови не позволяет определить истинный уровень вирусной нагрузки в отличие от использования в качестве биоматериала цельной крови. Использование образцов цельной крови для определения РНК позволяет выявлять более низкий уровень виремии, что имеет особое значение для раннего прогнозирования рецидива ГС-инфекции при проведении интерферонотерапии [46].

Как известно, вирусные геномы обычно присутствуют в биологических субстратах в малых количествах и для их выявления, количественной оценки необходима стадия предварительного усиления либо сигнала (разветвленная ДНК), либо мишени (ПЦР). Наиболее широкое применение для обнаружения РНК ВГС получили различные варианты ПЦР (Кэри Мюллис, 1983).

Основные молекулярно-генетические методы, применяемые для определения РНК ВГС:

1. ОТ-ПЦР (обратная транскрипция полимеразная цепная реакция) – метод ферментативной наработки количества копий специфических фрагментов комплементарной ДНК (кДНК) с предшествующим этапом обратной транскрипции (впервые успешно применен в 1989 г. рядом исследователей). Используемая в качестве фермента ДНК-зависимая ДНК-полимераза обладает термостабильностью в присутствии ионов марганца и магния и может быть одновременно использована для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК [14, 47]. Анализ результатов реакции может быть проведен «по конечной точке», как это реализовано в гель-электрофоретической и флуоресцентной детекции. Что позволяет увидеть лишь статичную картинку динамичного процесса.

Сейчас все более широкое распространение получает метод гибридизационно-флуоресцентной детекцией «в режиме реального времени» [44, 47, 48]. Отличительными чертами последнего являются:

- исключение контаминации на этапе детекции продукта реакции, поскольку регистрация результатов идет в закрытой пробирке непосредственно в момент проведения амплификации (упрощая процедуру проведения анализа);

- повышение чувствительности методики ПЦР позволяет выявлять низкокопийные пробы, снижая долю нетипированных образцов (100 МЕ/мл для «в режиме реального времени» в сравнении с 103 МЕ/мл при гель-электрофорезе);

- высокая специфичность благодаря применению олигонуклеотидных зондов, строго специфичных к амплифицируемому фрагменту;

- визуальное отражение течения процесса дает возможность оценки исходного количества копий кДНК в образце, что позволяет выбрать более адекватный метод лечения;

- автоматизированная система регистрации данных практически полностью исключает неверную трактовку результатов [43, 47].

С целью повышения чувствительности (в несколько раз) и контроля специфичности диагностических тестов для выявления РНК ВГС ряд исследователей применяют модификацию метода, так называемую «гнездовую» ПЦР. Отличие от «классической» методики заключается в одновременном использовании двух пар праймеров: внешние (прямой и обратный) для кДНК-матрицы с образованием 1-го ПЦР-продукта; внутренние праймеры(обычно короче по отношению к олигонуклеотидам начальной стадии реакции), которые комплементарно связываются с внутренним участком ампликона первого раунда амплификации с образованием 2-го ПЦР-продукта [5, 14].

Для детекции полученных продуктов амплификации используют электрофорез в горизонтальном геле. Применение универсальных праймеров, в отличие от типоспецифических, при постановке ПЦР-амплификации позволит их отжиг на матрице всех вариантов кДНК ВГС независимо от генотипа [5]. Но введение второго раунда амплификации и, как следствие, манипуляции с уже амплифицированным материалом увеличивает риск кросс-контаминации (из пробирки в пробирку), что может привести к получению ложноположительных результатов. Решается эта проблема с помощью постановки ПЦР в одной пробирке за счет разницы температур отжига наружной и внутренней пары праймеров [12, 14, 49].

2. Лигазная цепная реакция выявления РНК ВГС. Метод амплификации, основанный на способности фермента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать (лигировать) разрывы фосфодиэфирной связи в ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg²⁺. Для этого синтезируются два олигонуклеотида/праймера, комплементарные непрерывной последовательности кДНК ВГС: один – к 5'-концу, другой – к 3'-концу. После связывания с кДНК праймеры остаются разделены лишь одноцепочечным разрывом и термостабильная лигаза соединяет их в полинуклеотид. Лигирование не происходит при отсутствии целевой последовательности. Кроме того, специфичность реакции обеспечивается тем, что неполное спаривание праймеров с матрицей в пограничной области предотвращает их лигирование.

При последующей амплификации полинуклеотид и исходная кДНК служат матрицами для повторных циклов гибридизации, лигирования и диссоциации. Поскольку один праймер метится гаптеном или лигандом, а другой – с репортерной группой, появляется возможность детектировать полученные продукты непосредственно после амплификации, без использования электрофореза или секвенирования ДНК [14, 50]. Чувствительность метода составляет около 100 копий РНК ВГС в 1 мл [43].

3. Метод транскрипционно апосредованной амплификации (ТМА) отличается от ПЦР «в режиме реального времени» и лигазной цепной реакции тем, что непосредственно амплифицируются фрагменты РНК ВГС, а не кДНК. На начальном этапе реакции на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется кДНК. Обратная транскриптаза, обладая также активностью РНКазы Н, разрушает вирусную РНК в гибриде РНК-кДНК. Затем молекула кДНК достраивается до двуцепочечной. С помощью РНК-полимеразы происходит транскрипция РНК с кДНК, что приводит к образованию от 100 до 1000 копий ампликона РНК ВГС в одном цикле реакции. Образовавшиеся РНК-ампликоны специфически взаимодействуют с ДНК-зондами, меченными хемилюминафорами, учет результатов реакции осуществляют на люменометре.

К преимуществам ТМА-метода относятся:

- возможность проведения реакции при более низких температурах (в сравнении с ПЦР);

- образование большего числа ампликонов в одном цикле реакции, что уменьшает время для получения конечного результата (30-40 мин.) и повышает чувствительность реакции (50 копий/мл);

- снижение риска контаминации, так как РНК менее устойчива, чем ДНК. В ряде сравнительных исследований по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и других методов продемонстрировали высокий уровень совпадения результатов [19, 62]. В то же время, по данным С. Sarrazin (2002) применение ТМА позволило обнаружить РНК ВГС в 36% образцов, для которых был получен отрицательный результат с использованием ПЦР «в режиме реального времени». Впоследствии такие «ТМА-позитивные» пациенты рассматривались как лица, не ответившие на комбинированную терапию, с низким уровнем вирусной нагрузки [51].

4. Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода гибридизации с использованием разветвленных зондов. В отличие от ПЦР, в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбируются олигонуклеотиды/фрагменты РНК ВГС из 5'-NTR зоны и сore-региона, куда добавляется сывороточная РНК. За счет последующего связывания с синтетической молекулой разветвленной ДНК и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфатазой с усилителем, и последующей ферментативной реакцией достигается резкое увеличение полученного сигнала (хеми-, флуоролюминесценции). Чувствительность метода низкая – 2500 копий РНК ВГС в 1 мл [14, 50].

5. Метод гибридизации – образование двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов. Метод основан на соединении меченых гибридизационных зондов (генно-инженерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нуклеотидные последовательности, комплементарные избранным участкам РНК) с искомой последовательностью РНК, зафиксированной на нитро-целлюлозной мембране. Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса [14, 50]. Некоторые исследователи считают, что одностадийная ПЦР с последующей гибридизацией с олигонуклеотидными зондами (меченными радио или флуоресцентной меткой) по чувствительности не уступает двустадийной ПЦР с внутренней парой праймеров и предпочтительна при клинической диагностике инфекций, т. к. способствует снижению риска контаминации [50].

Для гепатита С этот метод прежде всего нашел свое применение для идентификации РНК непосредственно в гепатоцитах – в тестах in situ hybridization. Кроме того, гибридизация позволяет продемонстрировать наличие негативных (репликативных) цепей РНК ВГС. Доказано, что плюс-цепь не может служить критерием активной репликации при отсутствии минус-цепи – вирус находится в нерепликативной стадии. При сопоставлении наличия плюс- и минус-цепей РНК ВГС в тканях печени, периферических мононуклеарах и сыворотке крови было установлено, что минус-цепь выявляется только в присутствии плюс-цепи, обратная зависимость отсутствует [52, 50].

Генотипирование изолятов вируса гепатита С в настоящее время для гено/субтипирования РНК ВГС разработаны несколько методов, основанных на использовании ПЦР.

 

1.2.4 Значение определения генотипического разнообразия изолятов вируса гепатита С

 

Сведения о взаимосвязи воспалительного процесса в печени с конкретным генотипом вируса до конца не изучены и находятся на стадии изучения. Большинство исследователей указывают на то, что у больных, инфицированных 1 генотипом вируса, более активно протекает воспалительный процесс в печени и чаще развивается гепатокарцинома, но влияние генотипа оказывается все равно значительно меньше, чем у других факторов риска (например, употребление алкоголя и возраст пациентов). При этом доказано, что геносубтипирование ВГС и вирусная нагрузка являются важным фактором, определяющим эффективность противовирусного лечения, а следовательно, и его тактику [45].

По данным Национального института здоровья США пациенты, инфицированные ВГС 1-го генотипа, значительно хуже отвечают на противовирусное лечение препаратами интерферонов, чем больные со 2-ым и 3-им генотипами. Рядом отечественных и зарубежных авторов предполагается, что подобные различия в эффективности терапии могут быть следствием более медленного процесса разрушения гепатоцитов при инфицировании генотипом 1. Показан неодинаковый уровень вирусологического ответа на лечение и в зависимости от субтипа 1 генотипа ВГС. Так, считается, что больные с субтипом 1а хуже отвечают на комбинированное противовирусное лечение, чем пациенты с 1b [45]. Что касается других генотипов ВГС, то 4 плохо отвечает на интерферонотерапию, 5 большинство исследователей относят к относительно «благоприятным», а 6 занимает промежуточное положение по уровню устойчивого ответа на лечение [45, 43].

В настоящее время для пациентов, не ответивших на пегелированный интерферон в комбинации с рибаварином, перспективным считается использование прямых противовирусных препаратов, препятствующих основным этапам репликации вируса.

Определение генотипов ВГС имеет не только безусловно клиническое значение, но является перспективным для решения ряда эпидемиологических задач, включая генетическую характеристику вирусов, циркулирующих на определенной территории в динамике; отслеживание изменений в структуре путей передачи и выявление закономерностей распределения ВГС в популяции с целью прогнозирования изменений эпидемиологической ситуации, предотвращения дальнейшего распространения инфекции. На все эти вопросы позволяют ответить молекулярно-генетические методы типирования изолятов вируса.

Так, мониторинг генотипической структуры вируса в популяции позволяет судить о тенденциях распространения инфекций и возможных источниках инфицирования. Считается, что субтип 1а ассоциирован с внутривенным потреблением наркотических средств, а для 3а данные о подобной корреляции с этим путем передачи инфекции весьма неоднозначны; 1b часто связывают с заражением через медицинские манипуляции, гемотрансфузии и гемодиализ; 2-ой генотип значительно распространен среди лиц, инфицированных половым путем [8].

Кроме того, доминирование и возможный дальнейший рост доли 1-го генотипа, который значительно снижает эффективность интерферонотерапии, ведет к увеличению длительно существующих источников ГС-инфекции. Так и в случае создания кандидатной вакцины, возможность ее применения и эффективность также будут определяться степенью изученности популяционной структуры ВГС, а именно, знанием превалирующих генотипов [6].

Выводы по главе 1

Гепатит С – это инфекционное заболевание, вызываемое РНК-содержащим гепатотропным вирусом.

Гепатит С – инфекция, которая характеризуется первичной гепатотропностью, полиморфизмом клинических проявлений (феномен «айсберга»), длительным бессимптомным течением, исключительно высокой частотой хронизации (до 75-83%) с возможным переходом в цирроз (у 26-35% лиц с хроническим гепатитом С) и первичный рак печени (у 30-40% больных циррозом).

Вирус гепатита С представляет собой небольшой (55-65 нм в размере) сферический РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae. ВГС является причиной развития гепатита С в организме человека.

ВГС классифицируют по следующим генотипам (основным типам и подтипам): 1 (1a, 1b, 1 c), 2 (2a, 2b, 2c), 3 (3a, 3b), 4 (4a, 4b, 4c, 4d, 4e), 5
(5a), 6 (6a), 7 (7a, 7b), 8 (8a, 8b), 9 (9a), 10 (10a), 11 (11a).

Для заражения гепатита С, по сравнению с гепатитом В, необходима большая инфицирующая доза, поскольку концентрация вирусных частиц при гепатите С не превышает 4lg на 1 мл крови.

Для определения РНК ВГС применяют 5 молекулярно-генетических методов исследования, один из которых является ПЦР «в режиме реального времени».