Лекция №3. Масс-спектроскопия.

Основы метода. Область применения. Типы ионов: молекулярные, осколочные и метастабильные ионы. Техника приготовления образцов. Выбор оптимальных условий записи масс-спектров. Механизм образования масс-спектра (в газовой фазе, при десорбции и при испарении).

 

Основы метода

В основе метода масс-спектроскопии лежит относительно простая идея: молекулы вещества подвергаются ионизации тем или иным способом, образовавшиеся ионы сортируются по величинам их отношения масс/заряд, затем регистрируется число ионов для каждого значения этого отношения в виде спектра. Например, в широко используемом масс-спектрометре с ионизацией электронных ударом молекулы в паровой фазе бомбардируются пучком электронов с высокой энергией, а результат регистрируется в виде спектра положительных ионов, которые разделены по величинам масс/заряд (m/Z).

Метод относится к деструктивным методам (исследуемое вещество разлагается). При этом достигается намного большая чувствительность и скорость анализа. Масс-спектр вещества – это совокупность сигналов всех образовавшихся ионов, разделенных в зависимости от отношения их массы к заряду (m/Z).

Область применения

Масс-спектроскопия широко используется как для анализа соединений с известными масс-спектрами, так и для анализа совершенно неизвестных соединений. В случае известных соединений проводится сравнение их экспериментальных масс-спектров с библиотечными. В случае неизвестного соединения на основе данных по молекулярному иону, характеру фрагментации и других спектроскопических методов (например, ИК и ЯМР) его можно идентифицировать.

Типы ионов: молекулярные, осколочные и метастабильные ионы

Молекулярные ионы М⁺, которые имеют время жизни около 10^-5 с, регистрируются в масс-спектре. Массовое число М⁺ (m/Z) равно молекулярной массе соединения. Интенсивность пиков ионов зависит от стабильности М⁺ и варьируется в широких пределах. Если пик М⁺ отсутствует в спектре, снятом при 70 эВ, его обычно не удается зафиксировать и в спектре, снятом при более низких значениях ионизирующего напряжения.

Осколочные ионы образуются либо в результате простого гетеро или гомологического разрыва связей, либо в результате перегруппировочных процессах.

Основные ионы, обусловливающие масс-спектр соединения, возникают непосредственно в ионизационной камере, откуда они за время 10^-6 с поступают в бесполевое пространство между ионным источником и магнитным анализатором. Если ион распадается не в ионизационной камере, а в этом пространстве, то возникают так называемые метастабильные ионы. Эти вновь возникшие ионы отличаются по скорости от тех, что образовались в ионизационной камере, а в масс-спектре они проявляются в виде диффузионных пиков, форма которых резко отличается от формы пиков основных ионов.

Техника приготовления образцов

Для проведения анализа масс образца, который первоначально находится при атмосферном давлении, он должен быть введён в прибор таким образом, чтобы вакуум внутри последнего остался практически неизменным. Основными методами ввода образца являются прямое введение зонда или подложки или прямое вливание или впрыскивание (непрямой метод) в устройство ионизации.

При непрямом способе пробу вводят в масс-спектрометр в газообразном состоянии. Прямой ввод пробы используют тогда, когда проба труднолетучая.

Прямое введение заключается в использование прямого введения зонда/подложки – очень простой способ доставки образца в прибор. Образец сначала размещается на зонде, а затем вводится в ионизационную зону масс-спектрометра, обычно через вакуумный клапан. Образец после подвергается необходимым процедурам десорбции, таким как лазерная десорбция или прямое нагревание, чтобы обеспечить испарение и ионизацию.

Прямое вливание или впрыскивание: простой капилляр или капиллярная колонка используется для помещения образца в газообразной форме или в растворе. Прямое вливание также удобно, потому что оно позволяет эффективно вводить малые количества вещества в масс-спектрометр без нарушения вакуума. При исследовании жидких или твердых образцов их необходимо предварительно перевести в пар путем нагревания до температур порядка 500°С в условиях вакуума. Пробу испаряют в специальной камере, из которой пары в виде молекулярного пучка поступают через отверстие в ионизатор.

Выбор оптимальных условий записи масс-спектров.

На качестве масс-спектра сказываются некоторые рабочие характеристики прибора, которые необходимо постоянно контролировать и менять в зависимости от природы образца и условий съемки.

К ним относятся:

1. Разрешение прибора.

R_m характеризует возможности спектрометра раздельно детектировать максимально тяжелые ионы и оценивается отношением m/Δm, где m – наибольшая масса иона, при которой его пик перекрывается с соседними пиками (Δm=1) равной интенсивности на заданную долю их высоты (обычно 10 – 50 %). У спектрометров низкого разрешения величина R_m составляет от нескольких сотен до 1 – 3 тыс., а на приборах высокого разрешения она должна быть не менее 8 – 10 тыс., достигая у лучших современных моделей 100 – 150 тыс. В большинстве приборов разрешение можно менять в достаточно широких пределах, однако его увеличение связано с потерей чувствительности. Поэтому его обычно выбирают не меньшим, чем молекулярная масса анализируемого соединения, иначе спектр приобретает вид, изображенный на рис. 1, а: пики уширены, перекрываются и расчет их интенсивности связан со значительными ошибками.

Рис. 1. Влияние условий регистрации на качество масс-спектра:

а – разрешение прибора мало, пики расширены, разметка шкалы массовых чисел и расчет интенсивностей невозможны; б – большой фон прибора, обработка результатов невозможна; в – чрезмерное усиление сигнала, все главные пики зашкалены; г – для данной развертки неверно установлен частотный фильтр (пропускаемая частота слишком велика), невозможно выделить линии масс-спектров из-за шумов; д – пропускаемая частота мала, пики уширены, несимметричны и перекрываются, обработка спектра невозможна; г – фрагмент спектра, записанного в оптимальных условиях

 

2. Уровень фоновых сигналов.

Фоновые сигналы спектрометра, перекрываясь с пиками спектра анализируемого вещества, могут превышать допустимый уровень, что приведет к искажению интенсивностей линий спектра (рис. 1, б). Основные источники фона – загрязнение деталей спектрометра остатками предыдущих образцов. Вычитание фона при обработке спектров сопряжено с дополнительными погрешностями, при расчете вручную требует больших затрат времени и поэтому не всегда целесообразно. Для устранения фона обычно предварительно прогревают все элементы спектрометра, контактирующие с образцами, при температурах, превышающих рабочие, а также увеличивают количество анализируемого вещества до такого уровня, когда фоном можно пренебречь.

3. Усиление и скорость развертки спектров.

Степень усиления при записи спектрограмм приходится часто менять в зависимости от природы образцов, их количества и летучести. Слишком большое усиление сигналов приводит к зашкаливанию главных пиков, что делает обработку спектра невозможным (рис. 1, в). При недостаточном усилении теряются слабые пики. Запись сигнала фотоэлектронного умножителя требует дополнительной фильтрации, так как иначе даже слабые электрические шумы проявляются в виде хаотического набора сигналов, затрудняющих выделение пиков масс-спектра и разметку шкалы массовых чисел (рис. 1, г). Для устранения шумов используют фильтр частоты регистрируемых сигналов, причем пропускаемая им частота зависит от требуемой скорости развертки сигналов. Однако если пропускаемая им частота недостаточна, то наблюдается искажение полезным сигналов: уширение пиков, изменение их формы и т.д., что делает спектр похожим на спектр, записанный при недостаточном расширении прибора (рис. 1, д). На рис. 1, е приведен фрагмент масс-спектра, записанного на оптимальных условиях.

4. Стабильность вещества в системе напуска.

Ее следует особенно контролировать для таких термически неустойчивых или легко окисляющихся соединений, как перекиси, производные гидразина, сульфиды и т.д. Для этого необходимо проверять воспроизводимость спектров образца через определенные промежутки времени. Для пиков, превышающих 10 % от максимального, колебания интенсивностей не должны превышать ±30% их интенсивности; а для пиков, высота которых находится в интервале 1-10%, такие отклонения могут достигать ±50%(относительных). Невоспроизводимость, исчезновение и появление лишних пиков свидетельствуют об изменении вещества в системе напуска. Устранение этих эффектов может быть достигнуто снижением температуры системы напуска либо переводом нестабильных соединений в более устойчивые и более летучие производные. Подобные проблемы практически не возникают при вводе вещества в масс0спектрометр через хроматографическую колонку, отделяющую возможные примеси в образце непосредственно перед записью масс-спектров.

Механизм образования масс-спектра (в газовой фазе, при десорбции и при испарении)

1. Методы ионизации в газовой фазе

Эти методы применимы к соединениям, имеющим минимальное давление паров около 10^{-6 мм рт. ст. при температуре, при которой соединение сохраняет устойчивость; этому критерию отвечает большинство молекул с молекулярной массой менее 1000.}

а) Ионизация электронным ударом (ЭУ)

Молекула вещества пробы в газовой фазе подвергается бомбардировке пучком электронов с высокой энергией (обычно 70 эВ) и выбрасывает электрон, образуя катион-радикал, называемый молекулярным ионом. Потенциал ионизации молекулы органического соединения обычно ниже 15 эВ, поэтому бомбардировка электронами с энергией 50 эВ и выше сообщает избыточную внутреннюю энергию возникающему молекулярному иону. Часто избыточная энергия молекулярного иона слишком велика, что приводит к исчезновению его пика в масс-спектре. Понижение энергии электронного пучка позволяет получать пик молекулярного иона.

б) Химическая ионизация (ХИ)

При использовании ХИ: газреагент (метан, изобутан, аммиак и т.д.) вводится в источник и ионизируется. Молекуоы исследуемого вещества сталкиваются с ионизированными молекулами газа-реагента при относительно высоком давлении в камере ХИ и подвергаются вторичной ионизации путем переноса протона с образование ионов [М+1]⁺ и элетрофильного присоединения с образованием [М+15]⁺, [М+29]⁺, [М+41]⁺, [М+18]⁺ (в случае NH₄⁺). Ион [М]⁺ редко образуется за счет переноса зарядов. Информация о структуре молекул из спектров ХИ получается меньше. При ХИ часто образуется только один или два фрагментных иона, а иногда и ни одного.

Масс-спектры, полученные с использованием ХИ не пригодны ни для поиска в спектроскопических базах данных, ни для определения структуры. В основном они используются для детектирования молекулярных ионов и определения молекулярных масс.

2. Методы десорбционной ионизации

Основаны на том, что ионизированные молекулы пробы десорбируются непосредственно из конденсированной фазы в газовую. Недостатки: для обычных образцов не эффективны; часто несут только ограниченную информацию; в случае неизвестной структуры используют в первую очередь для определения молекулярной массы (возможно получение ненадежной информации).

а) Полевая десорбция (ПД)

Проба помещается на металлический эмиттер, на поверхность которого нанесены тонкие углеродные микроиглы. Эти микроиглы активируют поверхность на которую подается ускоряющий потенциал и которая функционирует как анод. Очень высокий градиент потенциала на концах игл ионизирует молекулу пробы, и возникший катион выталкивается с поверхности эмиттера. Такие ионы имеют небольшую избыточную энергию, фрагментация происходит в минимальной степени, т.е. обычно наблюдается только пик молекулярного иона.

б) Бомбардировка быстрыми атомами (ББА)

При ионизации в процессе ББА ксенона и аргона с высокой энергией (6 – 10 кэВ) облучают пробу в виде раствора в жидкости с низким давлением паров (например, в глицерине). Матрица защищает пробу от избыточного радиационного разрушения. В результате присоединения катионов образуются положительные ионы [М+1]⁺ или [М+23, Nа]⁺ и отрицательные ионы, возникающие при депротонировании [М-1]⁺; ионы обоих типов обычно имеют единичный заряд. ББА главным образом применяют при исследовании больших нелетучих молекул, особенно для определения молекулярной массы. Метод ББА сочетается с большинством типов анализаторов масс. Однако, самая сложная проблема, возникающая при использовании ББА, заключается в высоком уровне сигналов ионов вещества матриц, что ограничивает чувствительность и скрывает важные фрагментные ионы.

в) Плазменная десорбционная ионизация

Продукты распада ядер калифорния-252 (²⁵²Cf) с энергией порядка 80-100 МэВ используют для бомбардировки и ионизации пробы. При делении ядра ²⁵²Cf возникают две движущиеся в противоположном направлениях частицы. Одна из частиц попадает в триггерный детектор и сигнализирует о начале отсчета времени. Другая частица попадает на матрицу пробы, выбивая ионы, которые направляются во времяпролетный масс-спектрометр. Ионы имеют довольно низкую энергию, поэтому структурно полезная фрагментация наблюдается крайне редко. Можно использовать для анализа соединений с молекулярной массой вплоть до 45 кДа. (Да – Дальтон).

г) Лазерная десорбционная ионизация

Для ионизации проб в масс-спектрометрии можно использовать пульсирующий лазерный луч. Можно использовать для анализа соединений с молекулярной массой до 200 - 300 кДа. (Да – Дальтон). Несколько пикомолей пробы смешивают с матрицей, подвергают импульсному лазерному облучению, приводящему к образованию одноразрядных ионов вещества пробы, которые выбрасывают из матрицы в масс-спектрометр. Ионы обладают малой избыточной энергией и имеют небольшую склонность к фрагментации. По этой причине метод бывает полезен для анализа смесей. Недостаток – метод испытывает мешающее влияние фона матрицы, в результате чего отнесение молекулярного иона неизвестного соединения может оказаться неопределенным.

3. Методы ионизации при испарении

Методы основаны на том, что ионы или (реже) нейтральные молекулы, находящиеся в растворе (растворитель часто содержит муравьиную кислоту), при испарении растворителя одновременно подвергаются ионизации и последующему анализу.

а) Масс-спектрометрия с термораспылением

Раствор пробы вводится в спектрометр посредством нагретого капилляра. При распылении и частичном испарении растворителя образуется поток мелких капель, которые попадают в ионный источник. После полного испарения растворителя ионы пробы попадают в анализатор. В этом методе используют большие скорости потока исследуемого раствора и буферного газа.

б) Масс-спектрометрия с электрораспылением

Раствор пробы (обычно в полярном летучем растворителе) попадает в ионный источник через капилляр из нержавеющей стали, который окружен коаксиальным потоком распыляющего газа – азота. На наконечник капилляра подается высокий потенциал, создающий неоднородное электрическое поле с градиентом до 5 кВ/см. при выходе из капилляра раствор превращается в аэрозоль из заряженных капель. Поток распыляющего газа направляет аэрозоль в масс-спектрометр.

По мере испарения растворителя капельки аэрозоля сжимаются, а концентрация ионов пробы увеличивается. При достижении критического размера капель силы поверхностного натяжения становятся меньше сил кулоновского отталкивания. Происходит так называемый «кулоновский взрыв», приводящий к ионизации вещества пробы. После фокусировки сепараторами ионы попадают в анализатор масс-спетрометра.

Методы ионизации обобщены в таблице 1.

 

Метод ионизации	Образующиеся ионы	Чувстви-тельность	Преимущества	Недостатки
Электронный удар	М+	нг-пг	Возможность использования поисковых систем и баз данных, структурная информация	М+ иногда отсуствует
Химическая ионизация	М+1, М+18 и т.д.	нг-пг	Обычно присутсвует молекулярный ион М+	Мало информации о структуре молекулы
Полевая десорбция	М+	мкг-нг	Нелетучие соединения	Специальное оборудование
Бомбардировка быстрыми атомами	М+1, М+катион, М+матрица	мкг-нг	Нелетучие соединения, информация о порядке соединения фрагментов	Мешающее влияние матрицы, трудности при интерпретации
Плазменная десорбция	М+	мкг-нг	Нелетучие соединения	Мешающее влияние матрицы
Лазерная десорбция	М+1, М+матрица	мкг-нг	Нелетучие соединения, выброс ионов	Мешающее влияние матрицы
Термическое распыление	М+	мкг-нг	Нелетучие соединения	Вышел из употребления
Электро-распыление	М+, М++, М+++ и т.д.	нг-пг	Нелетучие соединения, сочетается с методом ЖХ (водной), образуются многозарядные ионы	Ограниченные классы соединений, мало информации о структуре молекул