Тема 10. Методы микробиологического исследования молока

 

Контрольные вопросы

1. Каким путем бактерии попадают в молоко?

2. Какова нормальная микрофлора молока?

3. Каким изменениям подвергается микрофлора молока во время хранения?

4. Способы уничтожения бактерий в молоке.

5. Качественная оценка молока:

а) определение микробного числа молока (проба на редуктазу, проба с резазурином, посев молока на плотную питательную среду);

б) определение кислотности молока.

 

Оборудование и материалы (на одно рабочее место)

Редуктазник, или водяная баня, пробирки на 20 мл, пипетки на 10-20 мл, бюретки, выпарительная чашка, стеклянная палочка, термометр, раствор метиленовой синьки (для редуктазной пробы), раствор резазурина, раствор фенолфталеина, 0,1% раствор щелочи (едкий натр), исследуемое молоко, стерильные чашки Петри, МПА.

 

Методические указания

Молоко содержит большое количество питательных веществ: сахара, жиры, соли, белки. Все это является прекрасным субстратом для развития и размножения разнообразных микроорганизмов, число которых достигает иногда нескольких миллионов в 1 мл.

При бактериологическом исследовании прежде всего определяют микробное число, т.е. содержание микробов в 1 мл. Определение ведут методом посева молока на плотные питательные среды, попутно проводят и другие исследования.

Метод посева молока на МПА в чашках Петри.

В штатив поставить пять пробирок со стерильным физиологическим раствором по 9 мл в каждой. В первую пробирку прилить 1 мл исследуемого молока и хорошо взболтать пипеткой (разведение 1:10), затем этой же пипеткой взять 1 мл болтушки и перенести во вторую пробирку, хорошо перемешать (разведение 1:100), новой стерильной пипеткой взять из второй пробирки 1 мл и перенести в третью (разведение 1:1000), из третьей в четвертую (1:10000), из четвертой в пятую (1:10000), каждый раз используя стерильную пипетку. Из пятой пробирки взять 1 мл болтушки и вылить в пустую стерильную чашку Петри, залить расплавленным МПА или сывороточным агаром (расплавленным в водяной бане и остуженным до 42⁰С) и хорошо перемешать питательную среду с внесенной болтушкой. Остудить чашку Петри, перевернуть вверх дном, подписать и поставить в термостат при температуре 30-32⁰С на 48 часов. После образования колоний проводят их подсчет двумя способами:

1. Непосредственно прямым подсчетом. Если колоний немного, их считают поштучно, отмечая тушью или восковым карандашом по дну чашки Петри. При большом количестве можно разделить на секторы, подсчитать в каждом отдельно, а затем сложить.

2. Подсчетом с помощью камеры Вольфгюгеля, когда образуется большое количество колоний, которое определяют в среднем на 1см² не менее чем в 10 квадратах. Затем вычисляют площадь чашки по формуле: S = πR² и умножают на число колоний в 1 см². Полученные результаты (число колоний в чашке Петри) умножают на разведение. Это и будет количество бактерий в 1мл молока (микробное число молока).

Проба на редуктазу

является косвенным методом определения бактериальной обсемененности молока. Находящиеся в молоке бактерии выделяют окислительно-восстановительный фермент редуктазу, которая обесцвечивает метиленовую синьку. Причем чем больше бактерий в молоке, тем больше выделяется редуктзы и тем быстрее обесцвечивается метиленовая синька.

Для выполнения работы в пробирку налить 5 мл исследуемого молока, добавить 1 каплю 1% раствора метиленовой синьки. Пробирку хорошо взболтать, поставить в водяную баню при температуре 38-40⁰С. Моментом окончания испытания на редуктазу считают полное обесцвечивание молока. Наличие синего кольца в верхней части пробирки не принимают во внимание. По времени обесцвечивания молоко делится на классы.

Проба с резазурином сходна с предыдущей, но преимущество ее в том, что анализ проводится быстрее, чем редуктазная проба. В стерильные пробирки наливают 1 мл рабочего раствора резазурина и 10 мл исследуемого молока, хорошо перемешивают и помещают в редуктазник с температурой воды 38⁰С. Время погружения пробирок в воду считать началом анализа. Показания снимают через 20 мин и через час.

После 20 мин пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из редуктазника. Оставшиеся пробирки оставляют до конца анализа. В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко относят к одному из четырех классов.