Объекты исследования в иммунологии (инбредные животные, биологические материалы для исследований, особенности работы с иммунокомпетентными клетками).

Объекты исследования

Для проведения фундаментальных исследований в иммунологии лучший объект – инбредные мыши.

Инбредные животные – животные, полученные путём инбридинга, т.е. последовательных близкородственных скрещиваний с целью получения гомозиготного и генетически идентичного потомства.

Среди потомков для дальнейших скрещиваний сначала отбирают особей по признакам внешнего сходства, в последних поколениях тестируют на совпадение групп крови и приживления кожных лоскутов. Через 20 поколений и более получают мышей с высокой степенью гомозиготности, обозначенных как чистая линия.

Главная цель выделения чистых линий – получение возможности много кратного повторения экспериментов на генетически одинаковых организмах, т.е. обеспечение воспроизводимости результатов исследования. Мыши стали основными экспериментальными животными в иммунологии, так как:

1. Имеют короткий срок беременности (21 сут), множественное потомство, что позволяет быстро вывести чистые линии

2. Себестоимость содержания

3. Структура и функции иммунной системы мыши и человека сходны

4. Выведение чистых линий мышей показало, что некоторые из них жизнеспособны, несмотря на гомозиготность, т.е. не всегда инбридинг приводит к вырождению.

Созданы линии мышей с заданными характеристиками, что позволяет выбирать особей для достижения конкретных целей. Характеристики животных разных линий документированы. Наиболее известные питомники: Джексоновская лаборатория в США ежегодно поставляет 2 млн. животных 2500 различных линий. 97% этих животных можно приобрести только у них. В каждом питомнике линии мышей имеют паспорт – систематизированы в базах данных. Известен гаплотип (Н-2) мышей разных линий, окрас, поведенческие реакции, особенности функционирования иммунной системы и др.

Кроме чистых линий выводят конгенных мышей. Это линии, отличающиеся небольшой частью генома. В основе выведения конгенных мышей лежит возвратное скрещивание – получение потомства в ряду поколений от скрещивания гетерозиготы (потомков гомозиготных родителей, генетически отличающихся между собой) с одним из исходных гомозиготных родителей. Это скрещивание проводится для внедрения комплекса Н2 донорской линии А в генотип основной линии В.

Например, при скрещивании маркирующей линии А и основной линии В получают гибриды первого поколения F1 (а/b, генерация I). При дальнейшем скрещивании гибридов F1 с особями основной линии В, получают потомство, состоящее из гомозигот (b/b) и гетерозигот (а/b) по комплексу Н2. В последующих скрещиваниях отбираются только гетерозиготные особи, имеющие признак А (Н2а), которые определяются по приживлению кожного трансплантанта от маркирующей линии А и положительной серологической реакции клеток крови с анти-А-сывороткой. По мере продолжения скрещиваний α-положительных особей с особями основной линии В доля генома линии А постоянно снижается, но при этом для дальнейшего размножения из потомства отбирают только тех особей, которые сохраняют признак А (Н2а). К 12 поколению (генерация №12) практически весь геном отбираемых после гибридизации мышей представлен основной линией В, за исключением признака А, по которому шёл отбор.

Дальнейшая задача состоит в переводе признака в гомозиготное состояние. Для этой цели гетерозигот (а/b) скрещивают между собой и отбирают для дальнейшего размножения только тех особей из потомства, которые отторгают кожный трансплантат, взятый от особи линии В и не дают реакции с анти-В-сывороткой. Этот отбор выявляет особей с присутствием признака В (Н2b) и гомозиготность по признаку А (Н2а). Таким образом, в результате применения данной схемы скрещивания, в геном основной линии В внедряется комплекс Н2 маркирующей линии А. С момента перевода комплекса Н2а в гомозиготное состояние констатируется получение новой конгентной (по отношению к основной) линии В.

Основные линии инбрендных мышей

1. Линии мышей с генетическими дефектами, затрагивающими иммунную систему. SCID – мыши, страдающие тяжелым иммунодефицитом в результате мутации в генах RAG, ответственных за перегруппировку генов Ig и Т-клеточного рецептора. Животные практически лишены Т- и В-лимфоцитов и могут жить в безмикробных условиях. Эти мыши не отторгают ксеногенные ткани.

В 1959 году Расселом описаны определенные частично инбредные мыши – спонтанные мутанты – самцы, которые вскоре после рождения покрывались чешуйчатой перхотью, отставали в росте, страдали диареей, умирали в возрасте 3 недель. У них наблюдалась массивная лимфоаденопатия, спленомегалия, аномальная инфильтрация лимфоцитами кожи, печени, лёгких. Мутантных самцов назвали «скурфи». В 2001 году было выявлено, что мутация «скурфи» затронула ген фактора транскрипции, локализованного в Х-хромосоме.

Nude (лишенные волосяного покрова) – выведенные в 1960 году мыши со спонтанной мутацией, в результате которой у мышей-гомозигот по данной мутации отсутствуют тимус и волосяной покров. Мутантный ген поддерживают при размножении мышей в гетерозиготном состоянии. AKR – белые мыши. У 90% мышей к 6-8 месяцу развиваются «спонтанные» тимомы и лейкоз.

2. Мыши с аутоиммунной патологией. NZB – новозеландские чёрные мыши с аутоиммунной гемолитической анемией. Сывороточные антиэритроцитарные Ат мыши связывают эритроциты, но не агглютинируют их.

(NZB×NZW) F1 – гибриды первого поколения чёрных и белых новозеландских мышей. У них спонтанно развивается синдром, напоминающий красную волчанку человека с гломерулонефритом. В крови содержатся Ат к ДНК.

ЕАЕ – мыши с аутоиммунным энцефалитом.

Биологические материалы для исследований в иммунологической лаборатории:

1) Цельная и периферическая кровь

2) Сыворотка крови

3) Плазма крови

4) Клетки крови, отделенные от жидкой фракции

5) Цереброспинальная жидкость

6) Синовиальная жидкость

7) Бронхоальвеолярный лаваж

8) Выделения слизистых секретов половых органов

9) Выделения из носа

10) Моча

11) Супернатанты, полученные от культивирования in vitro клеток

12) Гомогенаты тканей

13) Цитоплазматические и ядерные компоненты клеток

Биологический материал отличается по биохимическому составу, рН, ионной силе, вязкости. Каждая тест-система разработана строго для конкретного вида биоматериала и в 99% случаев – для сыворотки крови.

Тест-системы для анализа сыворотки крови не могут использоваться для работы с другими биоматериалами из-за высокой вероятности получения ложных результатов. Тест-системы для человека не могут применяться для работы с животными. Исключение – перекрестнореагирующие агенты (цитокин – трансформирующий фактор роста человека и свиньи).