IV. Тестирование теломеразной активности

Знание структурных и функциональных особенностей теломеразы

открывает дорогу для поиска ингибиторов и активаторов теломеразы.

И, в первую очередь, встает вопрос: каким образом могут быть изме-

рены снижение или повышение активности теломеразы? Это не прос тая

задача. Характерной особенностью теломеразы является низкое число

ее копий на клетку [173], а следовательно, и низкая активность, даже

в опухолевых клетках, где теломераза активирована [174]. На первый

взгляд, проще всего было бы прямо измерять влияниие ингибиторов

на активность выделенного фермента. Однако, такой прямой тест,

подхо дящий для кинетических исследований, доступен немногим.

Прямое измерение теломеразной активности основано на детекции

продуктов работы теломеразы при удлинении олигонуклеотида с

использованием α 32 P-меченного дезоксирибонуклеозид-трифосфата

как мономера [175–177]. В этом методе олигонуклеотид имеет нук-

лео тидную последовательность теломеры, что позволяет ему слу-

жить хорошим субстратом для удлинения теломеразой. Суммарная

радио активность присоединенной к этому олигонуклеотиду метки

про пор циональна теломеразной активности. Реакционная смесь

может быть проанализирована электрофоретически, что дает дополни-

тельную информацию о процессивности фермента. Из-за неудобства,

вызванного необходимостью использовать α 32 P-меченные нуклео тиды

с высокой удельной активностью, и из-за низкой чувствительности

метода, он не получил широкого распространения. Существуют

нес колько других методов определения теломеразной активности, и

кроме того, имеются коммерчески доступные наборы для измерения

актив ности фермента. Эти методы основаны на усилении сигнала с

помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР была впер вые

применена Кимом и др. для усиления сигнала от продуктов деятель-

ности теломеразы [178]. Такой метод получил название «ТРАП-тест».

Используя сведения о низкой специфичности теломеразы к субстрату,

авторы заменили олигонуклеотид с естественной теломерной после-

до вательности субстратным праймером (TS) с нетеломерной после-

до вательностью. Это позволило усилить сигнал в шаге ПЦР от

тело мераза-зависимого удлинения олигонуклеотидного субстрата,

подав ляя при этом ложно-положительное увеличение сигнала,

напри мер, за счет образования продуктов ПЦР из-за самоотжига

прай меров. Этот метод не являясь количественным, тем не менее

благо даря своей чувствительности и воспроизводимости получил

самое широкое распространение [179]. В дальнейшем, на стадии

ампли фикации сигнала, использовали ПЦР в реальном времени, что

188 М. Э. Зверева и соавт.

позво лило перейти к количественной оценке, создать протоколы,

идентифицировать и характеризовать теломеразные ингибиторы

[176, 177].

Используя __________методы измерения теломеразной активности на основе

ПЦР для изучения теломеразных ингибиторов, нужно иметь в виду, что

теломераза – специализированная ДНК-полимераза. Таким образом,

существует шанс, что исследуемое вещество предполагаемого тело-

ме разного ингибитора может также ингибировать процесс удлинения

праймера, катализируемый ДНК-зависимой ДНК-полимеразой в

ПЦР; поэтому необходимы дополнительные контроли.

Последующая характеристика теломеразных ингибиторов или

активаторов, может включать измерение эффектов этих веществ

на клеточных линиях опухоли. Для оценки действия препаратов на

клеточную культуру, широко используются два метода, которые раз-

ли чаются только по продолжительности обработки клеточной куль-

туры исследуемыми веществами. Так, краткосрочная (до двух суток)

обработка позволяет проводить измерение теломеразной активности

в экстракте, выделенном из обработанных таким образом клеток и

оце нить токсичность веществ. Долгосрочная обработка, приводящая к

изме римому сокращению теломер, скорее указывает на прекращение

ката литической деятельности теломеразы.

V. АКТИВАЦИЯ ТЕЛОМЕРАЗЫ

Основным ограничением использования низкомолекулярных соеди-

не ний, напрямую взаимодействующих с ферментом теломеразой и

усиливающих ее активность, является необходимость сохранения

оста точной теломеразной активности в ткани, где потенциально

может проявиться терапевтический эффект таких соединений. Воз-

мож ной мишенью таких соединений являются стволовые клетки реге-

нерируемых тканей, для которых характерна постоянная невысокая

теломеразная активность. Другой мишенью могут быть лимфоциты,

так же имеющие собственный низкий уровень теломеразной актив-

ности. Во время активации их роста, ферментативная активность

теломеразы возрастает в основном за счет фосфорилирования TERT,

вызы вающего изменение локализации белка в клетке [180]. Со време-

нем, эти клетки крови прогрессивно теряют свою способность уси-

ливать теломеразную активность, что приводит к репликативному

старению и к высоко дифференцированной популяции клеток [181].

Недавно этот процесс был рассмотрен детально [182]. Молекулы,

уве ли чивающие теломеразную активность, могли бы восстановить

Теломераза: компоненты и функции, регуляторы фермента 189

про ли феративную способность клеток крови, так же как и некоторые

другие функции.

Одним из наиболее многообещающих активаторов теломеразы

на настоящий момент являются разрабатываемые компанией Geron

низкомолекулярные соединения TAT0001 и TAT0002. Компания

анонсировала начало I/II фазы клинических испытаний этих веществ

(http://www.geron.com).

TA-65L, теломеразный активатор выделенный из китайского

рас тения Astragalus, был протестирован в пилотных клиничес-

ких испытаниях и проявил способность усиливать иммунитет и

сексуальную функцию, а так же улучшать состояние кожи (http://www.

tasciences.com).

Вещества, непосредственно действующие на теломеры или

тело меразу пока редки, но существуют несколько агентов, которые

про ти водействуют старению и усиливают теломеразную активность

косвенно. Эндотелиальные клетки, так же как и сосудистые клетки глад-

ких мышц, имеют низкую теломеразную активность. Несколько лет

назад было продемонстрировано, что введение hTERT в человеческие

эндотелиальные клетки увеличивает продолжительность их жизни

[177, 178].

Митохондриальная дисфункция, вызывающая повышенное

содер жание активных кислородных соединений (ROS) названа

главной детерминантой зависимого от теломер старения на уровне

одиночной клетки [183]. Антиоксиданты задерживают начало сосу-

дис того старения в теломер-зависимом пути. In vitro ROS снижают

уровень ядерного белка hTERT и теломеразную активность в эндо-

телиальных клетках. Это сопровождается ранним появлением фено-

типа старениия, в то время, как инкубация с антиоксидантом N-аце-

тил цистеином блокирует ядерный экспорт hTERT в цитозоль [184].

Токо ферол, известный антиоксидант, так же подавляет сокращение

длины теломер и сохраняет уровень теломеразной активности в клет-

ках капиллярных сосудов мозга [185].

Для активации теломеразы используются так же экстракты из

при родных объектов. Так, экстракт Gingo Biloba задержал начало

старе ния за счет стимулирования формирования теломеразы через

пере дачу сигналов PI3k/Akt-пути [186].

За последние десятилетие число неизлечимых хронических

деге неративных заболеваний существенно увеличилось. Разработка

мето дов их лечения должна включать поиски способов регенерации

тканей, которая может стимулироваться теломераза-активирующими

веществами. Таким образом, несомненно, имеется насущная необхо-

190 М. Э. Зверева и соавт.

димость дальнейших поисков и изучения теломеразных активаторов

(предпочтительно низкомолекулярных), которые могут быть исполь зо-

ваны в терапии дегенеративных заболеваний в ближайшем будущем.