Схема титрования гемолитической сыворотки

 

┌────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиенты │ Разведение гемолитической сыворотки │

│ опыта │ │

│ ├──────────┬──────────┬──────────┬──────────┬──────────┤

│ │ 1:1000 │ 1:1200 │ 1:1600 │ 1:1800 │ 1:2000 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Гемолитическая │ │ │ │ │ │

│ сыворотка (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ 3% взвесь │ │ │ │ │ │

│ бараньих эри- │ │ │ │ │ │

│ троцитов (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Комплемент в │ │ │ │ │ │

│ разведении │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Физ. │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Оценка │ │ │ │ │ │

│ результатов │ │ │ │ │ │

│ опыта │ - │ - │ - │ - │ ++ │

└────────────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┘

┌────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиенты │ Разведение гемолитической сыворотки │

│ опыта ├──────────┬──────────┬──────────┬──────────┬──────────┤

│ │ 1:2400 │ 1:2800 │ 1:3000 │ 1:3200 │ 1:3600 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Гемолитическая │ │ │ │ │ │

│ сыворотка (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ 3% взвесь │ │ │ │ │ │

│ бараньих эри- │ │ │ │ │ │

│ троцитов (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Комплемент в │ │ │ │ │ │

│ разведении │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Физ. │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Оценка │ │ │ │ │ │

│ результатов │ │ │ │ │ │

│ опыта │ ++ │ ++ │ ++ │ ++ │ ++ │

└────────────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┘

Титр гемолитической сыворотки 1:1800.

 

Для получения эритроцитов барана, кровь, взятую из яремной вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми бусами путем встряхивания в течение 10 - 15 минут, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4°С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б", выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов или каком-либо другом консерванте.

 

1-я схема постановки РСК.

Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Тирование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в 1 мл (таблица 2).

 

Таблица 2

 

┌──────────────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│Ингредиенты │ Дозы комплемента │

│ реакции ├─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┬─────┬──────┬─────┤

│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ разведении │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ 1:10 (мл) │ 0,1 │ 0,2│ 0,3 │ 0,4│ 0,5│ 0,6│ 0,7│ 0,8 │ 0,9 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Физиологи- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ческий │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│раствор (мл) │ 0,9 │ 0,8│ 0,7 │ 0,6│ 0,5│ 0,4│ 0,3│ 0,2 │ 0,1 │

└──────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────┴─────┴──────┴─────┘

 

Затем ставят опыт титрования комплемента.

 

Таблица 3

 

┌──────────────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиенты │ Дозы комплемента │

│ реакции ├─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┬─────┬──────┬─────┤

│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ различных │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│дозах (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Антиген (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Физиологичес- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│кий раствор │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Гемолитическая│ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ система (мл) │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2 │ 0,2 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Оценка резуль-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ татов │ 4+ │ 3+ │ 2+ │ + │ - │ - │ - │ - │ - │

└──────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────┴─────┴──────┴─────┘

 

Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37°С на 1 час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную предварительно в термостате в течение 30 минут), и через 30 минут производят учет результатов.

Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).

Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице комплемента при проведении связывания в термостате при +3°С в течение 1 часа.

 

Постановка основного опыта.

1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К различным разведениям их добавляют по 061 м; антигена и комплемента в рабочих дозах.

К каждому опыту ставят следующие контроли:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении +0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора. 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора);

5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют до ее титра;

6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют 2???? разведениях (1:10 - 1:40), включая так же как и для п. 5 контроля сывороток в исходных разведениях.

После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при + 37°С на 1 час.

2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят пробирки в термостат на 20 - 30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях.

 

2-я схема постановки РКС (по Fiset).

 

Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции - 0,6 мл упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при температуре +4°С 16 - 18 часов не в день постановки реакции, 1 - 2 раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских свинок и хранящегося при температуре не выше - 20 С (однако размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).

Титрование комплемента.

Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия сухого комплемента, содержимое ампулы растворяют в 10 мл физиологического раствора), из которого по схеме получают последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).

 

Таблица 4

 

┌─────────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиенты │ Разведения комплемента │

│ ├────────┬────────┬────────┬────────┬────────┬────────┤

│ │ 1:15 │ 1:18 │ 1:20 │ 1:25 │ 1:30 │ и т.д. │

├─────────────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┤

│ Комплемент │ │ │ │ │ │ │

│ 1:10 (мл) │ 1 │ 1 │ 0,5 │ 0,5 │ 0,5 │ │

├─────────────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┤

│ Физиологи- │ │ │ │ │ │ │

│ ческий │ │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,5 │ 0,8 │ 0,5 │ 0,75 │ 1,0 │ │

└─────────────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┘

 

 

Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу использованных в РСК антигенов) (таблица 5).

 

Таблица 5

 

┌─────────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиенты │ Разведение комплемента │

├─────────────────┴─────────────────────────────────────────────────────┤

│ Контрольный ряд │

│ (оценка качества комплемента) │

├─────────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬───────┬────────┬────────┤

│ │ 1:10 │ 1:15 │ 1:18 │ 1:20 │ 1:25 │ 1:30 │ и т.д. │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │

│различных │ │ │ │ │ │ │ │

│разведениях (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│Физиологический │ │ │ │ │ │ │ │

│раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│Гемолитическая │ │ │ │ │ │ │ │

│ система (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│Оценка резуль- │ │ │ │ │ │ │ │

│тата │ - │ - │ - │ - │ - │ + │ │

├─────────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴────────┴────────┤

│ Опытный ряд │

│ (оценка антикомплементарных свойств антигена) │

├─────────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬───────┬────────┬────────┤

│ Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │

│ различных │ │ │ │ │ │ │ │

│ разведениях │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│ Антиген в │ │ │ │ │ │ │ │

│ рабочей дозе │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│ Физиологи- │ │ │ │ │ │ │ │

│ ческий │ │ │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│ Гемолитичес- │ │ │ │ │ │ │ │

│ кая система* │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2 │ │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│ Оценка │ │ │ │ │ │ │ │

│ результатов │ - │ - │ - │ - │ + │ +++ │ │

└─────────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴────────┴────────┘

 

* Добавляют на второй день титрования комплемента (после 16 - 18 часов экспозиции при температуре +4°С).

 

Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при работе с этой серией комплемента и эритроцитов.

После 30-минутной экспозиции при температуре +37°С учитывают результаты.

При постановке реакции "холодным" методом (+0°С) рабочая доза комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге, рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 ил, поскольку, в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства антигена. Например, на 100 пробирок неодолимо приготовить 20 мл разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку), следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл физиологического раствора.

В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы комплемента.

При постановке реакции при +37°С рабочая доза комплемента составит 1 полную единицу, т. е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.

В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или полную единицу комплемента и ее половину (связывание при + 37°С). Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе +0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей дозе +0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в рабочей дозе +0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его на три - два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37°) для контроля используют 2 последние дозы.

 

Постановка основного опыта.

Инактивированные испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки (или лунки полистироловых панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,1 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе.

Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сывороток, в исходном разведении + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

3) контроль комплемента (как указано выше);

4) контроль гемолитической системы (0,4 мл физиологического раствора).

Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями. Положительную сыворотку разводят до ее титра. После тщательного встряхивания пробирки ставят в холодильник при +0°С на 16 - 20 часов (1-й этап реакции, таблица 6).

 

Таблица 6