РНГА с антигенным риккетсиозным эритроцитарным диагностикумом

РНГА с антигенным риккетсиальным эритроцитарным диагностикумом предназначена для обнаружения и титрования специфических антител риккетсиальной природы в исследуемых сыворотках людей.

Антигенный эритроцитарный диагностикум представляет собой лиофильно высушенную взвесь 3% формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных гидролизованным антигеном (гаптеном) риккетсий.

К антигенному эритроцитарному диагностикуму прилагается лиофильно высушенная 6% взвесь несенсибилизированных (контрольных) формалинизированных эритроцитов барана, предназначенных для контроля исследуемых сывороток и истощения их от неспецифических гемагглютининов, последнее может проводиться и неформалинизированными эритроцитами. Для разведения ингредиентов реакции используют формалинизированный физиологический раствор (ФФР).

Последний представляет собой 0,85% раствор хлорида натрия (pH = 7,0), к которому добавлен формалин из расчета 0,3 на 100 мл раствора хлорида натрия.

Ингредиенты реакции:

1) Исследуемая сыворотка или исследуемый антиген.

2) Антигенный риккетсиальный или иммуноглобулиновый риккетсиальный эритроцитарный диагностикум или антигены для РНГА.

3) Формалинизированные или негативные эритроциты барана.

4) Физиологический раствор, 1% раствор нормальной кроличьей сыворотки.

5) Формалин.

РНГА можно ставить как макрометодом в стандартных плексигласовых планшетах с лунками, так и микрометодом - в планшетах с лунками типа "U" микротитратора Такачи. При постановке реакции макрометодом эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 1,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 2 мл, а содержимое ампулы с контрольными эритроцитами - в 4 мл ФФР.

При постановке реакции микрометодом антигенный риккетсиальный эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 0,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 6 мл, а с контрольными эритроцитами - в 12 мл ФФР.

Исследуемые сыворотки перед постановкой РНГА инактивируют при +56°С в течение 30 минут и истощают эритроцитами барана. С этой целью вскрывают ампулу с контрольными эритроцитами, разводят ее содержимое в 4 - 12 мл ФФР (в зависимости от постановки макро- или микрометодом), после чего 5 мл полученной 1% взвеси эритроцитов центрифугируют в течение 5 минут при 2500 - 3000 об/мин. и надосадочную жидкость отсасывают. К осадку добавляют 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, перемешивают, выдерживают 30 минут при +37°С и центрифугируют в течение 5 минут при 2500 - 3000 об/мин. Надосадочную жидкость, представляющую собой истощенную сыворотку, исследуют в РНГА.

Постановка РНГА.

Вначале готовят исходное разведение исследуемой сыворотки (1:25). С этой целью к 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, истощенной эритроцитами барана, добавляют 1,5 мл ФФР.

Для приготовления последовательных разведений исследуемой сыворотки в 10 лунок горизонтального ряда планшета наливают по 0,4 (0,05) мл ФФР. В первую лунку добавляют 0,4 (0,05) мл исходного разведения (1:25) исследуемой сыворотки. После тщательного перемешивания переносят 0,4 (0,05) мл содержимого первой лунки во вторую, из второй переносят в третью 0,04 (0,05) мл и т.д. Из первой лунки 0,4 (0,05) мл смеси выливают. Затем в каждую лунку добавляют предварительно хорошо размешенного эритроцитарного диагностикума по 0,1 (0,025) мл, планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Учет результатов реакции - спустя соответственно 4 - 5 или 2 - 3 часа. Постановка опыта должна сопровождаться следующими контролями:

1. Контроль исследуемой сыворотки на отсутствие неспецифических гемагглютининов: в лунку планшета наливают 0,2 (0,025) мл исследуемой сыворотки в исходном разведении 1:25, добавляют 0,2 (0,025) мл ФФР и 0,1 (0,025) мл контрольных эритроцитов.

2. Контроль эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации: в 2 лунки, содержащие по 0,4 (0,05) мл ФФР, добавляют по 0,1 (0,025) мл эритроцитарного диагностикума.

3. Заведомо положительный контроль: постановка РНГА с тест-сывороткой к риккетсиям Провачека, прилагаемой к данной серии эритроцитарного диагностикума.

Учет результатов РНГА.

Учет результатов реакции проводят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Реакцию считают положительной (оценивают на "+"), если агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки, образуя по форме перевернутый купол с ровным или фасеточным краем. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное ее разведение, которое вызывает четкую агглютинацию эритроцитарного диагностикума.

Реакцию считают отрицательной (оценивают на "-") при оседании эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с четким ровным краем. В сомнительных случаях реакцию оценивают на "+-".