Непрямой метод флуоресцирующих антител.

Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА) или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют с целью выявления специфических антител у больных и переболевших риккетсиозами людей и животных.

Метод используют следующим образом. В ампулу с сухим риккетсиальным корпускулярным антигеном за 2 часа до приготовления препарата добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения корпускул риккетсий влагой. Из этого основного разведения готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающей в каждом поле зрения примерно до 100 риккетсиальных клеток. На предметном стекле, хорошо вымытом и обезжиренном, наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На каждое стекло наносят 8 капель. Этого количества достаточно для испытания одной сыворотки. Если в вашем распоряжении имеется взвесь антигена, то с ней поступают следующим образом: из основного раствора готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающей в каждом поле зрения около 100 риккетсиальных клеток. На предметное стекло, хорошо вымытое и обезжиренное наносят по 8 капель антигена, тщательно перемешанного пипетированием в соответствующем рабочем разведении кончиком канцелярского пера или туберкулиновым шприцем со срезанным концом.

Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или ацетоном (приобретенные антигенные пятна уже зафиксированы) в течение 20 минут и сохраняют до использования при температуре от 0 до +4°С, в пределах месяца. Препараты необходимо оберегать от увлажнения.

Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30 минут при +56°С, готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (от 1:20 до 1:2560, а при необходимости и выше).

Капли из соответствующих разведений сыворотки наносят на мазки антигена и выдерживают 45 минут во влажной камере при +37°С. Затем препарат промывают фосфатным буфером (pH = 7,2 - 7,4) в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

После высушивания на мазки наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере 30 минут при +37°С. В качестве антивидовых препаратов применяют люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека и животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется использование бычьего альбумина, меченого родамином или 0,1% раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов. Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно антивидовой люминесцирующей сывороткой.

Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливает свечение риккетсий на "++", при наличии свечения на "+++" или "++++" в предыдущем разведении.

Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей антивидовой сывороткой в рабочем разведении.

2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих антител.

Прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА) используется с целью выявления риккетсиальных антигенов в биологических пробах и объектах внешней среды.

Метод осуществляют следующим образом. На тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла делают тонкие мазки или отпечатки исследуемого материала. После высыхания мазки фиксируют этиловым спиртом или ацетоном в течение 30 минут. По мазку восковым карандашом делают ряд окружностей диаметром 0,5 см, в зависимости от количества искомых антигенов, чтобы создать барьер, препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.

На эти поля фиксированных и высушенных мазков наносят по капле разведенных флуоресцирующих сывороток против искомых антигенов (рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом Эванса 0,1% или бычьего альбумина, меченого родамином (в смеси оба раствора должны быть в рабочем разведении). В контрольное поле наносят гетерологичную флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 минут при температуре +37°С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном растворе (pH = 7,2 - 7,4) в течение 10 минут. После ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют в люминесцентном микроскопе.

Учет результатов реакции.

Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, объектив 90х, окуляр 10х или 7х. Первичные светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС 7-2; БС-8-2, окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатом и изотиоцианата флуоресцеина).

Просматривают не менее 10 - 20 полей зрения. Оценку результатов пМФА проводят на основании количества, яркости флуоресцеина и морфологических особенностей риккетсий. Для этого используют условную систему обозначения при помощи крестов:

"+++++" - яркая, сверкающая флуоресценция;

"+++" - отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с характерными для данного флуорохрома цветов (в данном случае зеленый).

Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого свечения комплекса антител с поверхностным антигеном;

"++" - флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;

"+" - флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий различима плохо, цвет неопределенный;

"-" - флуоресценция отсутствует.

Результат считается положительным при обнаружении в некоторых полях зрения не менее 5 риккетсий с интенсивностью свечения возбудителя не менее, чем на "+++" при четко отрицательном контроле.