Биологический метод Фортнера

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну полови­ну засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растоп­ленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, ко­гда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

18. Типы и сущность процессов питания бактерий. Классификация бактерий по типам питания. Основные принципы культивирования бактерий.

Микроорганизмы используют питательные вещества дляпостроение компонентов бактериальной стенки и для получения энергии. По характеру захвата пищи бактерии относятся к ОСМОФИЛАМ, т.е. питаются веществами, растворёнными в воде. Как и др мк они нуждаются в большом кол-ве минеральных в-в (С, О, N, S, Р, Са, Fe и др).

Основным источником углерода для б! могут служить неорг соед-я (чаще СО2), из которых мк синтезирует орг в-ва – это АУТО- или ФОТОТРОФЫ (синегнойная палочка). Если же мк нуждаются в орг соед-ях, к/е служат им источником углерода и азота, то их наз. ХЕМО- или ГЕТЕРОТРОФАМИ. В результате ассимиляции и окисления орг в-в (из прир соед-й чаще всего исп-ся полисахариды – крахмал, целлюлоза), выделяется азот.

Помимо этих в-в, мк необходимы доп в-ва – факторы роста, к ним относится большое кол-во АК, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины. Они входят в состав микробной , но синтезировать их самостоятельно они не могут, поэтому факторы роста обязательно должны присутствовать в пит среде у некоторых б!!. Если мк нуждаются в факторах роста – АУКСОТРОФЫ, если нет – ПРОТОТРОФЫ.

Ферменты делятся на экзоферменты, которые выделяются в окружающую среду, где они расщепляют питательные вещества. Эти вещества поступают внутрь клетки, где расщепляются эндоферментами.

По постоянству действия:

- Ферменты, постоянно участвующие в обменных процессах - конституитивные. Они принимают активное участие в синтезе структурных компонентов.

- Ферменты, действующие только при наличии субстрата – адаптационные: ферменты транспорта и катаболизма лактозы

Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых случаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3—5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, ко-торые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку. Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом». Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара.. Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода. Для определения нитритов используют реактив Грисса: Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов

19. Принципы и методы выделения и идентификации чистой культуры бактерий. Этапы исследования.

Основные принципы культивирования бактерий:

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надг писывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры). Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.). Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав. По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до-бавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки осо-бого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застыв-шем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными. По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий. Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д. Дифференциально-диагностическиепитательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) мик-роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи-мической активности вследствие неодинакового набора ферментов. Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов. В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы(МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях. Требования, предъявляемые к питательным средам. Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.

20. Биохимические свойства бактерий. Определение. Методы изучения и практическое использование в микробиологической диагностике инфекционных заболеваний.

Биохимические признаки. Для определения споасобности микроорганизмов ферментировать углводы испоьзуют короткий и длинный «пестрый» ряд.К первому относят среды Гиса с моно и дисахаридами.В длинный в добавление к этим входят также индол,крахмал, гликоген,глицерин. И. т.д.В качестве индикатора(реактив Андреде) во все среды добовляют.Посев инкубирую при темп 37 в течен 18-24 часов.В том случае если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды и газ при разложении газообразн. продуктов.При отсутствии ферментации цвет не меняется.

Для определ протеолитических ферментов производят посев культуры уколом в столбик с 10-20% желатина При температ.20-22 градус. Несколько дней.При наличии фепрмент бактерии разжижают желатин.(образ воронка или елочка) Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бумаги укрепляют так, чтобы она не соприкасалась с пит средой.Посинение бумаги говорит о присутствии аммиака. Реакция на индол. Способ Эрлиха.В пробирку с культурой бактерии прибавляют2-3 каол.эфира несколько капель реактива Эрлиха.В присутствии индола –розовое окрашивание.. Реакция на сероводород. Делают посев культуры уколом в столбик с пит средой. При наличии сероводорода –почернение агара. Обнаружеение каталазы. На предметное стекло наносят каплю перекиси водородо3% и вносят в нее петлю с бактериальной культурой.Каталаза разлогает перекись водорода на кислород и воду.выделение пузырьков водорода свидетельств. О присутств каталазы.

Биохимические признаки определяют для идентификации культур бактерий.

биохимические —тип окислительного и пластического метаболизма, ферментацию углеводов, протеолитические и другие признаки.

21. Понятие об антибиотиках. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Механизм действия.

В 1942 г. появился термин «антибиотик»-высокоактивных метаболических продуктов микроорганизмов,избирательно подавляющих рост различных бактерий и некоторых опухолей. Антибиотики классифицируют и характеризуют по происхождению,химическому составу, механизмам ингибирующего действия на микробные клетки, антимикробным спектрам, частоте возникновения антибиотико-резистентных форм бактерий.По химическому составу антибиотики подразделяют на несколько групп.1. Бета-лактамные антибиотики, или бета-лактамы, — азотсодержащие гетероциклические соединения с бета-лактамным кольцом. К ним относится группа пенициллина, и группа цефалоспорина (цефалоридин, цефалексин, цефамандол,),2. Тетрациклин и его полусинтетические производные: окситетрпциклин, хлортетрациклин Они состоят из четырех конденсированных бензольных колец с разными радикалами.3. Аминогликозиды, к которым относятся группа стрептомицина и аминогликозидные антибиотики, 4. Макролиды — соединения, содержащие макроциклическое лакюнное кольцо (эритромицин, олеандомицин).5. Левомицетин, представляющий собой синтетическое вещество,идентичное природному антибиотику хлорамфениколу, в состав которою входит нитрофенил, дихлорацетамин и пропандиол.6. Рифамицины, к которым относятся природный антибиотик рифамицин и его полусинтетическое производное рифампицин7. Полиеновые антибиотики — нистатин, леворин, амфотерицин В,имеющие несколько сопряженных двойных связей — (СН=СН)-. По механизму антимикробного действия антибиотики в значительной мере отличаются друг от друга. «М и ш е н ь ю» для

их ингибирующего действия служит одна или несколько биохимических реакций необходимых для синтеза и функционирования определенных морфологических компонентов или органелл микробной клетки: клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, рибосом, нуклеоида Антибиотики оказывают на микроорганизмы, главным образом на бактерии, б а к т е р и о с т а т и ч е с к о е и л и б а к т е р и ц и д н о е д е й с т в и Бензилпенициллин и его полусинтстические производные, все цефалоспорины, аминогликозиды, рифамицины) обладает бактерицидным действием. Некоторые антибиотики (левомицетин, тетрациклин, макролиды) оказывают на чувствительные к ним бактерии бактериостатическое действие.По антимикробному спектру антибиотики подразделяют на две

группы: узкого и широкого спектра действия. К антибиотикам у зк о г о с п е к т р а относится бензилпенициллин, антибиотики нистатин, леворин, амфотерицин ВАнтибиотики с ши р о к и м с п е к т р о м действия обладаютантибактериальной активностью в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий. относятся цефалоспорины третьего поколения, тетрациклины, левомицетин, аминогликозиды, макролиды,рифампицин.