Дифференциация Р. anatipestifer от иерсиний и других пастерелл

 

Тест	Пастереллы				Yersinia pseudotuber culosis
	P. multo-cida	P. anati-pestifer	P. haemo-litica	P. galli-narum
Гемолиз	-	-	+	-	-
Агар MacConkey’s	-	-	обычно +	-	обычно +
Индол	+	обычно -	-	-	-
Подвижность	-	-	-	-	+
Желатин	-	+	-	-	-
Каталаза	+	+	+	-	+
Оксидаза	+	+	+	+	-
Уреаза	-	различно	-	-	+
Глюкоза	+	-	+	+	+
Лактоза	обычно -	-	обычно +	-	-
Сахароза	+	-	+	+	-
Мальтоза	обычно-	-	обычно-	+	+

Известно несколько антигенных вариантов по результатам РА. Herry (1969) сообщил о 8 серотипах (от А до Н), тогда как Sandhy (1981) - до 15 (от А до О). По наличию преципитирующего антигена выявлено 7 сертипов (2).

Р. anatipestifer содержит шесть капсульных антигенов – a,b,c,d,e,f. Соматические представлены Р-протеином, освобождающемся при лизисе клеток, и М-протеином, поверхностным, в оболочке.

Бактерии неустойчивы к факторам внешней среды. В МПБ с добавлением 5% сыворотки крови млекопитающих хранятся не более 7-10 суток. Температура плюс 50⁰С инактивирует в течение 10 минут, а 55⁰С – 1 минуты. При минус 17⁰С сохраняются до 2 месяцев, от 0 до минус 6⁰С – 15 суток. На деревянных изделиях, подстилке и в корме при 15-18⁰С сохраняют инфекционность до 3 суток, в водоемах – 50 дней.

Дополнение. Пастереллез – общий термин, используемый для обозначения нескольких болезней, вызываемых пастереллами, группой широко распространенных бактерий неопределенного родства. У птиц это болезни – холера (пастереллез) домашних птиц, псевдотуберкулез, инфлюэнца гусей и инфекции P. Anatipestifer, P. hemolitica, P. gallinarum и другие.

Сравнение физиологических характеристик, чувствительности к антибактериальным агентам и структуры ДНК показало, что P. anatipestifer отличается как от моракселл, так и от многих представителей большой группы пастерелл. Она относится к другому роду.

Бактерии, вызывающие гемофилез, патогенны для лабораторных животных. После интраперитонеального введения у мышей развивается септицемия с летальным исходом. Внутривенное введение агента кроликам вызывает токсический процесс. Культуры клеток первой генерации непостоянно патогенны для морских свинок. Вирулентность возбудителя снижается при хранении в пересевах на питательных средах.

Эпизоотологические данные. Гемофилез – контагиозная болезнь многих пород домашних уток, гусей и других видов птиц. Многолетние наблюдения показывают идентичность эпизоотического процесса, клинических симптомов и патологоанатомических изменений у уток и гусей, у которых выделены P. anatipestifer и P. septicaemiae. Птица восприимчива в любое время года. Болезнь протекает в виде эпизоотических вспышек.

В естественных условиях наиболее часто болеет молодняк от 2- недельного до 3-месячного возраста. Источником возбудителя являются больные и переболевшие утки, выделяющие бактерии с экскрементами и секретами. Заражение происходит алиментарно и через поврежденную кожу. Не исключен аэрозольный способ проникновения возбудителя в организм птицы. Летальность утят составляет от 5 до 75% в зависимости от патогенности бактерий.

Возбудитель может быть изолирован от фазанов, индеек, диких водоплавающих и цыплят кур.

По данным Зеленского В.П. (1968), молодняк гусей восприимчив к заболеванию в мае, июне, августе и сентябре (2, 3).

Болезнь легко вызвать экспериментально у утят культурой P. anatipestifer после внутривенного, подкожного, интраперитонеального и интратрахеального введений, а также «per os».

Взрослые куры, гуси, голуби, крысы и мыши к инфицированию устойчивы. Морские свинки могут заболеть от больших доз, введенных интраперитонеально. Цыплята 5-7-суточного возраста погибают от введения в мякиш лапки ноги 8 млн. бактериальных клеток. 4 млн. P. anatipestifer вызывает клинические признаки, гибель и характерные патологоанатомические изменения у 2-недельных китайских гусят и 2-недельных пекинских утят. Птица может заболеть от респираторного или парентерального введения пастерелл.

Возможно воспроизвести гибель утят после укола в перепонку ноги.

Инфекционная кориза водоплавающей птицы – болезнь, вызываемая P. anatipestifer совместно с Mycoplasma gallisepticum, является серьезной проблемой для стран Латинской Америки, Африки и Азии.

Для профилактики гемофилёза применяют бактерины и, во многих странах, вакцины на основе аттенуированных штаммов агента. Возбудитель не обладает отрицательной гемолизирующей активностью, индол - отрицательный, расщепляет нитраты и глюкозу. Сахарозу и маннит не разлагает.

H. influenza обладает непостоянно гемолитическим свойством. Манит и сахарозу не разлагает. Гемагглютинация - отрицательно, тогда как индол, нитраты и глюкоза - положительно. Другой серотип пастерелл обитает в организме кур как комменсал и при этом является возбудителем коризы у птиц. Он не культивируется в средах с добавлением 1% NaCl. В экспериментальных условиях не патогенен для взрослых птиц.

H. influenza после перитонеального введения вызывает септицемию у мышей. У кроликов при инокуляции внутривенно отмечают интоксикацию. H. infiuenza чувствительна к ампициллину, хлорамфениколу и гентамицину.

Сотрудники госинститута в Ческе-Будеевице (Чехословакия, 1997) сообщили, что возбудитель инфекционного серозита утят и гусят P. anatipestifer был выделен в двух утиных и одном гусином хозяйстве. Всего выделили 13 штаммов (5 утиных и 8 гусиных). Инфекция возникла во второй половине откормочного сезона. Клинические признаки: понос, атаксия и расстройство нервной системы. Заболевание следует отличать от колисепсиса, сальмонеллёза, орнитоза, ботулизма, менингитов, вирусных гепатитов утят и гусят. Патологоанатомические изменения характеризовались фибринозным серозитом. Наблюдали фибринозный эпикардит и перикардит, аэросаккулит, катаральный энтерит. Возбудитель выделяли из сердца, мозга, яйцевода, используя аэробные культуры, особенно шоколадный агар. Большое значение в возникновении заболевания имеют стрессы. В лечении используют антибиотики и сульфаниламиды (6).

Течение и симптомы болезни. Инкубационный период при искусственном пероральном заражении варьирует от 1 до 8 суток.

Инфекция протекает в сверхострой, острой, подострой и хронической формах.

Сверхострая форма характеризуется внезапной гибелью утят в течение 24 часов без проявления клинических признаков.

При острой форме наблюдают общее угнетение и нарушение координации движений: слабость ног, раскачивание туловища и опрокидывание на спину. Птица бьёт головой или ногами о подстилку. Подобные признаки продолжаются не более двух суток и нередко заканчиваются гибелью.

Подострое течение гемофилеза утят и гусят по проявлению идентично и продолжается 4-10 суток. Здесь могут наблюдаться следующие симптомы: повышение температуры тела до 43-44°С, наличие клонико-тонических судорог мышц шеи (голова находится на спине), птица мало двигается, дыхание у нее затруднено, иногда с хрипами. Больные особи прогрессирующе худеют, впадают в коматозное состояние и нередко погибают. Летальность среди утят составляет от 35 до 75%, взрослого поголовья гусей до 40%.

Хроническая форма длится более 10 суток. При данной форме болеет птица в 3-месячном возрасте и старше. Отмечают вышеописанные симптомы, но в менее выраженной степени.

Asplin (1955) описал острую и хроническую формы с характерными признаками – истечение из глаз и носа, кашель как признак бронхита, диарея с зеленой массой, атаксия, тремор головы и шеи, кома. Заболевшие утята часто погибали, выжившие обладали напряженным иммунитетом (1).

Патогенез. Бактерии размножаются в крови птицы, вызывая комплекс патологических изменений: пролиферацию эндотелия сосудов селезенки с дистрофией и некробиозом клеток, зернистую дистрофию эндотелия канальцев почек, диффузное ожирение гепатоцитов и дистрофию ганглеозных клеток головного мозга.

Патологические изменения. После сверхострой формы в трупах утят обнаруживают отек легких, незначительное увеличение селезенки и редко кровоизлияния на эпикарде. У птиц, павших после острой и подострой форм, отмечают скопление серозного эксудата и отложение фибрина в полости перикарда, фибринозный перитонит и перигепатит. Стенки воздухоносных мешков покрыты фибрином в виде тонкой сетки серовато-желтого цвета.

В эпикарде кроме фибрина содержатся моноциты, первичные мононуклеарные клетки и гетерофилы. При фибринозном аэросаккулите в экссудате преобладают мононуклеарные клетки.

При хронической форме наблюдают многоядерные гигантские клетки, фибробласты и экссудат. У инфицированных утят может быть острая пневмония.

Изменения в печени, наблюдаемые в острой форме, включают слабую перипортальную мононуклеарную инфильтрацию лейкоцитами и дегенерацию паренхимальных клеток.

В центральной нервной системе бактерии вызывают фибринозный менингит. Селезенка увеличена и пестрая. Слизистый экссудат в носовых синусах и казеозный экссудат в яйцепроводе. При естественном заражении утят описан диффузный фибринозный менингит с инфильтрацией лейкоцитов вокруг стенок мозговых кровеносных сосудов. Умеренная инфильтрация лейкоцитов и микроглии имеет место в перивентрикулярной мозговой ткани.

У гусей легкие покрыты многочисленными узелками фибрина, рельефно выделяющимися на фоне здоровой ткани органа. Нередко фибринозные образования находятся в бронхах и альвеолах. Печень увеличена, глинисто-красного цвета, дряблая. Селезенка увеличена в 2-6 раз, темно-вишневого цвета; после хронической формы – плотная с четко выраженной зернистостью (название «саговая» селезенка). В почках зернистая дистрофия. Головной мозг гиперемирован. Легкие кровенаполнены и отечны. В трупах гусей иногда выявляют геморрагический энтерит (2, 3, 9).

Диагноз и дифференциальная диагностика. Диагноз ставят на основании результатов эпизоотологического обследования, клинических признаков, патологоанатомических изменений и бактериологических исследований.

Для изоляции возбудителя гемофилеза проводят посевы из крови, содержимого перикарда, экссудата глаз, головного мозга, печени и селезенки на кровяной агар, сывороточный МПБ. Питательные среды выдерживают при 37-38°С в течение 3-5 суток. Мазки-отпечатки исследуемых проб органов и культуры выделенных бактерий окрашивают по Граму. Затем надосадки 10% суспензий проб органов, а также взвесь культуры бактерий проверяют на патогенность методом внутримышечного или подкожного введения 20-30-суточным утятам или гусятам и белым мышам.

В положительном случае у птицы клинические признаки гемофилеза проявляются на 1-8 сутки с последующей гибелью. Реизоляция бактерий подтверждает специфичность гибели утят от гемофилеза и достоверность постановки диагноза. Белые мыши устойчивы к заболеванию.

Результаты биохимических исследований выделенных бактерий дополняют информацию о выделенном возбудителе; P. anatipestifer обычно разжижают желатину и карбогидрат-отрицательные.

Серологические тесты для диагностики не проводят. В 1961 году Marschall et al. успешно испытали МФА для идентификации возбудителя в тканях органов павших и экссудатах больных птиц (8).

Гемофилез необходимо дифференцировать от пастереллеза, колибактериоза и парвовирусной инфекции гусей и мускусных уток.

Пастереллезхарактеризуется постоянным наличием кровоизлияний на серозных и слизистых оболочках внутренних органов трупов утки, а также изменениями в кишечнике (дуоденит). Пастерелла окрашивается по Граму отрицательно, биполярно. Обладает патогенностью для белых мышей.

Колибактериоз регистрируют у птицы с первых суток после вывода. Из признаков наиболее отличительный - наличие катарально-геморрагического энтерита, поражение яйцевода, селезенка не увеличена. E. coli обладает специфичностью роста на дифференциальных средах, биохимическими свойствами и патогеностью для цыплят кур.

Парвовирусная инфекция гусей и мускусных уток– вирусная болезнь молодняка гусей и мускусных уток. Для профилактики применяют высокоэффективные вакцины.

Иммунитет. Бактерии обладают иммуногенной активностью. Сыворотки крови уток-реконвалесцентов содержат специфические антибактериальные антитела, сдерживающие заболевание птицы в течение трех месяцев.

Лечение. Выбор антибиотиков проводят согласно результатам определения чувствительности выделенных культур бактерий к антибиотикам. Из сульфамидов ранее использовали сульфатиазол, сульфамезатин (0.2%) с водой, 2000 ЕД пенициллина дважды внутримышечно в течение 5 суток, или комбинации пенициллина со стрептомицином, сульфаквиноксалин, сульфадиметок.

Выявлена высокая эффективность действия энрофлоксацина против Riemerella anatipestifer на мускусных и пекинских утятах в экспериментальных условиях. Определена кинетика энрофлоксацина в сыворотке крови утят после орального применения 10% раствора байтрила.

Страчунский А.С. и др. (2002) определяли чувствительность H. influenzae людей с помощью Е-тестов (АВ Biodisk, Швеция) на среде НТМ (Haemophilus Test Medium), рекомендованной NCCLS (Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам США). Среду НТМ готовили на основе агара Мюллера-Хитон с добавлением дрожжевого экстракта (Oxoid, Великобритания) до конечной концентрации 5 мкг/мл и специальных добавок НТМ supplement (Oxoid, Великобритания), создающих необходимые для роста бактерий факторы Х (гематин), и V (НАД) в конечной концентрации 15 мкг/мл среды.

Для тестирования использовали взвесь 1-суточной культуры бактерий, соответствующую стандарту мутности 0,5 по Мак Фарланду.

Чашки инкубировали в течение 16-18 часов при температуре 35⁰С в СО₂ - инкубаторе (5-7% СО₂).

Для контроля качества определения чувствительности использовали штаммы, рекомендованные NCCLS: H. influenzae ATCC 49247 и АТСС 49766 (Американская типовая коллекция культур). Анализ результатов проводили с использованием компьютерной программы M-Lab (НИИАХ, Смоленск).

Результаты тестов, проведенных в Москве и Смоленске, показали, что люди в молодом возрасте в 44% являются носителями H. influenzae. Выделенные микроорганизмы чувствительны к В-лактамным антибиотикам – ампициллину, амоксициллину, амоксициллину/клавуланату и цефаклору, из макролидных антибиотиков – кларитромицину. В то же время бактерии устойчивы к ко-тримаксозолу (в разных странах резистентность к нему колебалась от 1,4 до 50%, 1996-1997 гг.) (4).

Профилактика и меры борьбы. После установления диагноза на гемофилез больную птицу убивают и уничтожают внутри хозяйства, подозрительную в заболевании обрабатывают лекарственными средствами. Утятам дают антибиотики с кормом в течение 10-12 суток. Помещения, где находилась птица, выгулы и территории, прилегающие к ним, очищают и дезинфицируют. Уток обеспечивают полноценным кормлением и улучшают условия их содержания.

Для предотвращения болезни, вызванной P. anatipestifer, используют инактивированные вакцины. Моновалентные формолвакцины из штаммов 1,2 и 5 дают гомологичную защиту, но не защищают против гетерологичных серотипов. Трехвалентная вакцина защищает против каждого штамма, но иммунитет непродолжительный (2).

Список литературы

1. Болезни птиц. – Изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: Колос, 1971. - С. 243.

2. Зеленский, В.П. Профилактика и лечение инфекционных болезней птиц / В.П. Зеленский. - Минск, 1968.

3. Крылов, М.В. Инфекционные и инвазионные болезни водоплавающих птиц / М.В. Крылов, А.Б. Терюханов - Л.: Колос, 1975. – 150 с.

4. Чувствительность к антибиотикам Haemophilus influenzae, выделенных у здоровых детей из организованных коллективов / Л.С. Страчунский, О.И. Кречикова, Г.К. Решедько [и др.] // Клинич. микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. - Т. 4, № 1. - С. 33-41.

5. Dose response study of enrofloxacin against Riemerella anatipestifer septicaemia in muscovy and pekin ducklings / A. Turbahn, S.C. de Jackel, E. Greuel [e. a.] // Avian Pathol. – 1997. – Vol. 26, N 4. – P. 791-802.

6. Efficacy of enrofloxacin against experimentally induced riemerella anatipestifer in muscovy and pekin ducklings / A. Turbahn, S.C. de Jackel, E. Greuel [e. a.] // 11^th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc. – Budapest, Hungary, 1997. – P. 125.

7. NAD independent haemophilus paragallinarum: effects on diagnosis and control / R.R. Bragg, J.M. Greyling, J.M. Welgemoed [e. a.] // 11^th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc. – Budapest, Hungary, 1997. – P. 52.

8. Rachac, V. Izolace puvodce infekcni serozitidy u kachnat a housat [ Выделение возбудителя инфекционного серозита от гусят и утят] / V. Rachac, P. Vladik. – Veterinarstvi. – 1987. – T. 37, N 8. – S. 367-371.

9. Rhoades, K.R. Pasteurella anatipestifer infection / K.R. Rhoades, R.B. Rimler // Disease of Poultry. - 8^th ed. – Ames, Jowa, 1984. - P. 160-163.

 

 

ГЕПАТИТ В

(совместно с к.м.н. Лисициной Е.В.)

Гепатит В (гепаднавирусный гепатит уток) – широко распространённая и малоизученная персистирующая инфекция, характеризующаяся антигеномией, виремией, признаками острого или, чаще, хронического гепатита, развитием экстрацеллюлярной гепатокарциномы и длительным вирусоносительством.

Историческая справка. Первые сообщения о гепатите В уток были опубликованы в Китае и США (1980) (25). Manson W.S. et al. обнаружили гепаднавирус, идентичный по морфологическим свойствам возбудителю гепатита В (ВГВ) человека. В 1984 году были опубликованы результаты регистрации ВГВ пекинских уток (DHBV) в Германии и на острове Тайвань. В дальнейшем гепатит зарегистрировали у журавлей, гусей, аистов и змей (3, 4). Гепаднавирус широко распространён среди земляных белок, сусликов, лесных сурков, а также у людей во многих странах мира (3, 4, 6, 9, 20). В России инфекция выялена в 2004г. по факту обнаружения структур генома вируса в сыворотках крови клинически здоровых пекинских уток, содержащихся в птицехозяйствах Республики Башкортостан и Московской области (Груздев К.Н., Князев В.П. Михайлов М.И.,Захаров В.М. и др. ВНИИЗЖ, 2006г.).

Экономический ущерб состоит из затрат на проведение тестов по выявлению гепатита В и мероприятий по ограничению распространения агента и ликвидации инфекции в неблагополучных хозяйствах.

Возбудитель. Гепаднавирус (Hepadnavirus) относится к роду Aviаhepadnavirus семейства Hepadnaviridae, включающего вирусы гепатита В человека, земляных белок и лесных сурков. Вирус имеет геном в виде двухнитевой ДНК, сердцевину, построенную по типу кубической симметрии, и внешнюю липидо-белковую оболочку. В составе вирусных частиц возбудителя обнаружена ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Методом перекрестной гибридизации ДНК установлена гомология нуклеиновых кислот гепаднавирусов уток, сурков, белок и человека. Утки не обладают Х-геном, что отличает гепаднавирус данного вида от других представителей семейства. Tavis J.E. et al. (1998) представили доказательства связывания полимеразы ВГВ уток С прогеномной РНК на 5`-конце, необходимой для её функциональной активности. Ими показана возможность получения рекомбинантной полимеразы, экспрессированной в Saccharomyces cerevisiae, которая обладает аутентичным свойством вирусной полимеразы. ε-шпилька непосредственно стимулирует полимеразу. Домен обратной транскриптазы в полимеразе физически изменяется при взаимодействии с ε-шпилькой. Анализ 15 мутаций в различных областях полимеразы показал, что зависящее от ε-шпильки изменение полимеразы является предпосылкой для праймирования ДНК обратной транскрипции и трансреакции, которая зависит от матрицы экзогенной РНК (32).

В США (1999) клонирована и секвенирована кДНК из клеток печени уток. Рецептором вируса гепатита В уток является гликопротеин Р170 поверхности клеток, имеющий молекулярную массу (мол. м.) 170кД. Домен pre-S белка вируса связывается с гликопротеином р170 главным нейтрализующим эпитопом, в котором два основных остатка (R101 и R102) необходимы для взаимодействия гепаднавируса с гликопротеином Р170. Были получены специфические антитела к гликопротеину Р170, ингибирующие заражение возбудителем болезни. В настоящее время известны праймеры для обратной транскрипции и ПЦР-амплификации геномной ДНК ВГВ человека, а также зонды для обнаружения этих вирусов.

Поверхностные (оболочечные) антигены ВГВ млекопитающих между собой родственны, но не обладают перекрестной реакцией с детерминантами утиного вируса (5). Значительная идентичность аминокислот обнаружена между продуктами гена HВsAg и полимеразы вирусов человека и уток. Robinson W.S. (1985) сообщил, что поверхностные антигены ВГВ лесного североамериканского сурка антигеннородственны и создают минимальную перекрёстную реакцию с НВsAg человека. Кроме того, два основных полипептида ВГВ земляной белки (суслика) на 33% идентичны с НВsAg. Это доказывает, что три вируса (человека, сурка и белки) произошли от одного общего предшественника. Тогда как поверхностные антигены вируса уток не проявляли серологической перекрёстной реакции с подобными антигенами вирусов млекопитающих (28). Утиный вирус содержит один основной полипептид (17 500 дальтон) со значительно более низкой гомологией, что свидетельствует о его меньшей идентичности с вирусами животных. До 1985 года ещё не были выяснены вариации поверхностных антигенов сурков, белок и уток.

Ядерные нуклеокапсиды (коры вирионов) вируса сурков и белок идентичны вирусу человека, тогда как коры вируса уток отличаются от них шиповидной структурой, выступающей с поверхности ядерных частиц, а вирионы являются плеоморфными.

Полиморфизм вируса уток выражен наличием сферических и нитевидных форм с диаметром от 35 до 60 нм. Длина нитевидных частиц достигает 500 нм. Размер cердцевины составляет 27-28 нм, тогда как расположенных на ней шипиков – до 2 нм.

Выявлены некоторые особенности, отличающие ВГВ уток от других представителей семейства. Например, вероятность обнаружения вирусных частиц ЭМ в пробах сывороток крови уток ниже, чем в пробах от сурков, белок и человека. Кроме того, не представляется возможным обнаружить неполные формы вирионов с диаметром 22 нм в сыворотке крови инфицированной птиц. Неоднократные исследования сывороток крови уток на предмет обнаружения вирусных частиц и изучения их морфологических свойств показали, что у птицы преобладают хрупкие и более крупные по размеру вирионы, чем у млекопитающих и человека (26). Плавучая плотность вируса в хлористом цезии 1,16 г/см³, тогда как у других трех - 1,25 (неполные вирионы имеют 1,19-1,20г/см³). Кроме полных вирионов, из печени инфицированных уток можно изолировать субвирусные частицы, подобные нуклеокапсиду, которые обладают ДНК-полимеразной активностью.

Вирионы состоят из протеина, липидов и карбогидрата. Идентифицированы два мажорных и пять минорных полипептидов. Выявленные три фосфолипида и два гликолипида определены как производные клеточной мембраны.

В настоящее время идентифицирована gp-180-гликопротеин клеток хозяина размером 180 кДа, который специфично связывается с поверхностью оболочки вируса гепатита В уток. Эта связь ингибируется антивирусными нейтрализующими моноклональными антителами. Дополнительно были определены детерминанты, необходимые для связывания gp-180 с участком из 66 аминокислот, находящимся внутри pre S участка домена, кодирующего оболочку. Липиды, содержащиеся в оболочке, составляют от 3,6 до 6,5%.

Гепаднавирус инактивируется при 60^○С в течение 10 часов. Многократные замораживания и размораживания не влияют на его инфекционную активность. В присутствии эфира (20%) стабилен в течение 18 часов. Растворы формалина (0,1%) и фенола (2%) инактивируют его за 24 часа. Чувствителен к ультрафиолетовому облучению и воздействию бета-пропиолактона. При этом поверхностный антиген (HBsAg) вируса имеет более высокий уровень стабильности: не инактивируется при 60ºС в течение 10 часов, не чувствителен к обработке эфиром, хлороформом и мочевиной (1:1). Антиген сохраняет серологические и иммуногенные свойства при воздействии температурой 58-62ºС в течение 3 недель, при 100ºС - 5 минут. Полностью теряется его серологическая активность после обработки этиловым или бутиловым спиртами (16).

Вирус преимущественно репродуцируется и аккумулируется в печени инфицированной утки. Результаты, связанные с заражением УЭ, показали, что минус-нить вирусной ДНК можно выявить в печени спустя 2 часа после внутривенной инъекции агента. Одновременно его специфические антигены были обнаружены в клетках поджелудочной железы и канальцах почек.

Обычно вирус хорошо культивируется в желточном мешке УЭ. Его репликация воспроизведена и в первичных клетках гепатоцитов уток. Носик Н.Н. сообщил, что Fourel I. et al. в 1989 году изучили пролонгирование репликации вируса гепатита В в гепатоцитах уток, сокультивированных с эпителиальными клетками крыс. Культуру клеток гепатоцитов от естественно зараженных вирусом гепатита В пекинских уток можно использовать в два раза дольше, если ее сокультивировать с эпителиальными клетками печени крыс. Использование селективной среды, в которой аргинин и глюкоза заменены на орнитин и лактат, позволяет продолжать репликацию вируса, инициированную in vivo в течение 2 месяцев. Репликацию вируса контролируют путем тестирования ДНК ВГВ уток в культуральном супернатанте и в клетках методом молекулярной гибридизации (5).

ДНК и полипептиды гепаднавируса индуцируют специфические антитела, обладающие преципитирующей активностью и пригодные для тестирования в ИФА.

У больных взрослых уток гепаднавирус индуцирует выработку интерферона, обладающего антивирусным свойством.

Для дифференциации гепаднавируса необходимо предоставить краткую информацию о возбудителе гепатита В человека, путях его передачи, индуцировании болезни, диагностике и эффективности лечения, что в целом отличает его от ВГВ уток (4).

Итак, вирус гепатита В человека - ДНК-содержащий, 42 нм в диаметре, антиген оболочки – НВs. Передача парентеральная, которая наиболее часто встречается у больных наркоманией, а также у лиц с риском инокуляции через кровь и гомосексуалистов. Инкубационный период – 2-4 месяца, желтуха появляется у 20% больных; диагноз острого гепатита устанавливают по наличию JgM HBc-антител. В 90% случаев инфекция излечима, а в 10% - становится хронической. HBs Ag присутствуют в сыворотке с другими маркерами или без них (HBc Ag и вирусной ДНК). При отсутствии вирусных маркеров репликации болезнь неконтагиозна. Молниеносный гепатит, в 80% случаев вызывающий летальный исход, встречается 1 раз на 100-1000 больных. Эффективность лечения интерфероном и видарабином составляет 30%. Вакцинация безопасна и эффективна (4, 26, 28).

Проведён детальный анализ эволюционной истории ВГВ с использованием 39 гепаднавирусов млекопитающих и человека, у которых уже известна полная последовательность генома. Филогенетический анализ показал отсутствие единого места происхождения ВГВ. Построение филогенетических деревьев определялось моделью замен в молекуле ДНК. В некоторых случаях доминирующий на американском континенте генотип F дивергировал первым, из чего следует, что вирус возник в Новом Свете – Америке. При других построениях наиболее дивергировавшими были последовательности генотипа В, господствующего в Восточной Азии. В отношении генотипа С не выявлена связь между временем и числом замен в молекуле ДНК. Характер и скорость замены нуклеотидов ВГВ - очень сложный процесс и не позволяет в настоящее время реконструировать эволюцию распространения вируса (6).

Эпизоотологические данные. Гепатитом В в естественных условиях болеют утки пекинской и других пород, а также журавли, аисты и гуси с проявлением персистирующей инфекции при большой концентрации вируса и его антигенов в сыворотке (плазме) крови уток. Mason W.S. et al. (1983) утверждают, что около 10% уток в коммерческих хозяйствах Калифорнии (США) обладают виремией. При обследовании 500 проб сывороток крови утят пекинской породы было установлено, что 6% из них были инфицированы возбудителем гепатита В (26).

Гепатит В, как утверждают Fernholz D. et al., является эпидемической инфекцией домашних уток (20).

Вирус не имеет строгой принадлежности к одному хозяину. Kruse W. (Германия) в течение пяти месяцев (1985-1986 гг.) методом дот-блот-гибридизации тестировал 481 пробу сывороток крови домашних пекинских уток, 700 - перелетных уток нескольких видов, 598 - гусей в хозяйствах Германии, Венгрии и Нидерландов. Результаты исследований показали, что 2,54% поголовья пекинских уток были хронически больны гепатитом В. У перелетной птицы вирус не идентифицирован, тогда как 35 проб сывороток крови гусей содержали возбудитель болезни в высокой концентрации. При обследовании гусиных хозяйств, расположенных в Германии (1988), было установлено, что 6,2% поголовья птицы разновозрастных групп были инфицированы гепаднавирусом уток; в пробах сывороток крови методом дот-блот-гибридизации был обнаружен вирусный геном (ДНК) в концентрации 7,69х10^9,0см³ (23).

У больных уток вирус и его субвирусные частицы содержатся в крови, печени, поджелудочной железе, селезенке и почках. В Российской Федерации (2004) вирусный геном выявлен у 14% уток пекинской породы производственного назначения. В ФГУ ВНИИЗЖ (2004 – 2005гг.) Князевым В.П. проведены тесты по воспроизведению инфекции на заведомо здоровом (без наличия генома и антигенных структур в крови) молодняке уток. Скрининг сывороток, проведённый в течение двух лет, показал инфекцию без прявления клинических признаков и макроскопических патологоанатомических изменений (отсутствие новообразований).

Источник возбудителя инфекции - больные взрослые утки-производители инкубационных яиц. Выявлен трансовариальный путь передачи вируса. Дополнительно к этому Tsiquaye K.N. et al. в 1985 году сообщили о наличии горизонтального пути распространения вируса (34).

Воспроизведение инфекции в экспериментальных условиях показало 100% контаминирование агентом УЭ, полученных от инфицированных уток. В желтке неинкубированных яиц находили возбудитель, которым заражается развивающийся эмбрион на ранних стадиях инкубации. С шестого дня эмбриогенеза гепаднавирус можно обнаружить в печени, а с десятого - его субвирусные структуры в сыворотке крови. В последующем у 63% выведенных утят с 3-суточного возраста выявляли острую форму гепатита В. Опыты по изучению ДНК-полимеразной активности и обнаружению вируса показали, что экспериментальная инфекция протекает так же, как и при естественном трансовариальном пути передачи возбудителя.

Для выявления серопозитивности уток кровь из яремной вены можно исследовать посредством дот-блот-гибридизации с помощью полномерного ДНК-зонда. Оболочечный антиген вируса обнаруживали пероксидазно-антипероксидазным методом ИФА, где применялись кроличьи поликлональные антитела против оболочечных структур после очистки их центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Структуры вирионов из сыворотки постоянно тестировали методами электронной микроскопии.

K. Viskery и Y. Cossart воспроизвели ГВ на утятах 1- и 26-суточного возраста, при этом определив, что инфицирующая доза для утят старшего возраста превышала в 1000 раз таковую у 1-суточных утят. Эти утята оказались выремичными к 7 дню и сохраняли виремичность в течение всего эксперимента. У более взрослых утят 100-1 000 доз индуцировали вирусоносительство или острую форму проявления ГВ. В дальнейшем у некоторых уток, по результатам непрямого ИФА, виремия исчезала при 50% сохранении DHBV в печени инфицированной ранее птицы. Все – 1- и 26-суточные утята, показали наличие сывороточных анти-core-антител.

Seawright A.A. et al. обнаружили чрезвычайно высокую чувствительность пекинских уток, больных ГВ, к интоксикации афлатоксином В₁ (AFB₁), что было подтверждено активным образованием продуктов детоксикации AFQ₁ и AFМ₁. Дополнительно они сообщают, что у бурундуков, инфицированных гепаднавирусом В, развивается первичный рак печени с умеренным воспалением ткани, а у людей и лесных североамериканских сурков, больных ГВ, рак печени тоже часто развивается на фоне значительного токсического повреждения ткани печени (29).

Взаимодействие гепаднавируса уток и AFB₁ в организме уток было менее заметно, чем у крыс и других животных, так как вирус, в основном, расположен в негепатоцитных клетках.

Основываясь на результатах тестов, Seawright A.A. et al. (1993) пришли к выводу, что взаимодействие AFB₁ и гепаднавируса уток не является многообещающей моделью для изучения гепатита В человека (10).

Экспериментально подтверждено, что шимпанзе не чувствительны к вирусу гепатита В уток (3).

Признаки хронической формы болезни уток были связаны с трансовариальной передачей гепаднавируса. Они проявляются гепатитом средней степени, лимфоидной инфильтрацией в перипортальной зоне печени и, вероятно, воспалением печени. У птицы часто регистрируют только переменную виремию.

Течение и симптомы болезни. В естественных условиях гепатит В регистрируют преимущественно как хроническую (персистирующую) инфекцию. Некоторые исследователи утверждают, что существует острая форма болезни, основным признаком которой является виремия.

Обнаружение в высоких концентрациях вирионов (частиц Дейна), вирусной ДНК или маркеров (антигенов) возбудителя в структурах органов и крови трансовариально инфицированных утят указывает на отсутствие инкубационного периода для обеих форм болезни.

В естественных условиях гепатит В в течение 1-2 лет протекает без характерных клиниче­ских признаков до развития у птицы некробиоза, фибринозных и дегенеративных изменений в печени.

Вирус, находящийся в крови и органах больной птицы, не оказывает влияния на уровень яйценоскости, выводимость и жизнеспособность молодняка. Развитие острого гепатита и наличие карциномы, ассоциированной с гепатитом В, можно выявить у естественно зараженных взрослых уток только при патологоанатомическом вскрытии. Экспериментальные исследования показали возможность сокращения бессимптомного периода до 4-5 месяцев, а по некоторым данным - до 3-недельного срока, после парентерального введения вируса утятам в 3-суточном возрасте (6, 9, 10, 15, 20, 22, 25, 34, 35, 36, 37).

Патогенез окончательно не выяснен. В эмбрионах естественно инфицированных уток вирус гепатита В присутствует в желтке, эпителиальных клетках желточного мешка и печени. Трансовариально зараженные утята с первых дней после инкубации уже содержат вирус в крови. Результаты экспериментальных исследований показали репликацию возбудителя в клетках селезенки, поджелудочной железы и почек через 6 недель после парентеральной инъекции гепаднавируса утятам в односуточном возрасте. Как при естественном, так и искусственном заражении, вирус, персистирующий в крови, индуцирует образование неопластических гепатоцитов, изменения в межклеточных структурах печени, развитие острого или хронического гепатита, а также экстрацеллюлярной карциномы (30, 37).

Патологоанатомические изменения. Для гепатита В, независимо от способа инфицирования (искусственного: внутривенного - УЭ, внутримышечного - утятам в 1-суточном возрасте, или естественного (врожденного, парентерального заражения вирусом уток-производителей), характерен и постоянен один признак - поражение печени: развитие гепатита и гепатоцеллюлярной карциномы уток в возрасте 1-2 лет.

Наиболее доступно динамику изменений в органах больной утки можно проследить при экспериментальном искусственном заражении птицы. После внутримышечного введения вируса утятам 1-суточного возраста патологоморфологические изменения в печени развивались аналогично таковым при конгенитальном инфицировании. До 1-недельного возраста существенных аномалий не отмечают (20). Вакуоли гепатоцитов содержат липиды и гликоген; немногочисленное количество лейкоцитов находится в портальной части печени. К 6-недельному возрасту происходит умеренная лимфоцитарная инфильтрация, которая располагается около мелких желчных протоков и кровеносных сосудов. Некоторые гепатоциты, единично расположенные в паренхиме, некротизированы в период с 3 по 6 меся