В1. Экстракция РНК из 100 мкл образца, лизис вне прибора

Порядок работы

1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК, следуя инструкции к прибору.

2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции РНК –плазма (Plasma), объем образца (Volume) – 0,1 ml, объем элюции (Eluate) – 55 mkl, тип образца (Type) – Lysed, очередность экстракции РНК в образцах (Priority) – normal.

3. Создать новый протокол экстракции РНК и сохранить его. В протоколе указать, что лизис и инкубация образцов происходит вне прибора: On - board Lysis Buffer Dispensing - No, On - board Lysis Incubation - No.

4. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.

5. В ячейки картриджа easyMAG, предназначенные для экстракции РНК в приборе NucliSENS easyMAG, внести по 450 мкл буфера для лизиса NucliSens.

6. В каждую ячейку добавить 100 мкл исследуемой плазмы отдельным наконечником с фильтром, тщательно перемешать пипетированием.

7. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в приготовленную ячейку картриджа ПКО-1 с буфером для лизиса NucliSens добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную ячейку картриджа ПКО-2 с буфером для лизиса NucliSens добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, тщательно перемешать пипетированием.

8. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в ячейку картриджа с буфером для лизиса NucliSens добавить 100 мкл ОКО, тщательно перемешать пипетированием.

9. Оставить картриджи с образцами на 10 мин при комнатной температуре для прохождения лизиса.

10.В отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл смешать магнитную силику NucliSens и ВКО стерильными наконечниками c фильтром (см. табл. 5).

Таблица 5

Приготовление смеси магнитной силики и ВКО

Количество образцов для экстракции РНК	Количество магнитной силики NucliSens, (мкл)	Количество ВКО, (мкл)
1	10	10
8	90	90
16	170	170
24 (полная загрузка прибора)	250 (с запасом на 25 проб)	250

11.Добавить в каждую ячейку отдельным наконечником по 20 мкл подготовленной смеси магнитной силики NucliSens и ВКО. Жидкость в каждой ячейке тщательно перемешать пипетированием с помощью дозатора отдельными наконечниками с фильтром на 1000 мкл.

12.Загрузить картриджи с образцами в прибор, установить наконечники, запустить программу экстракции РНК с лизисом образцов вне прибора (Off board).

13.После окончания экстракции РНК, извлечь картриджи из прибора и не позднее 30 мин после окончания процедуры экстракции РНК провести реакцию ОТ-ПЦР.

Для длительного хранения препарат необходимо перенести в одноразовую пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес или не выше минус 68 °С в течение года.

В2. Экстракция РНК из 100 мкл или 1000 мкл образца с автоматическим лизисом в приборе

Порядок работы

1. Лизис образца происходит в автоматическом режиме в приборе NucliSENS easyMAG. В каждую ячейку картриджа easyMAG, предназначенную для экстракции РНК в приборе NucliSENS easyMAG, необходимо добавить 100 мкл или 1 мл исследуемой плазмы отдельным наконечником с фильтром.

2. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в ячейку картриджа, предназначенную для ПК-1 добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в ячейку картриджа, предназначенную для ПК-2 добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ.

3. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в ячейку картриджа, предназначенную для ОК, добавить 100 мкл ОКО.

4. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК, следуя инструкции к прибору.

5. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции РНК –плазма (Plasma), объем образца (V olume) – 100 mkl или 1 ml, в зависимости от объема используемого клинического материала, объем элюции (Eluate) – 55 mkl, тип образца (T y pe) – Primary, очередность экстракции РНК в образцах (P riority) – normal.

6. Создать новый протокол экстракции РНК и сохранить его. В протоколе указать, что лизис и инкубация образцов происходит в приборе: On-board Lysis Buffer Dispensing –Yes, On-board Lysis Incubation – Yes.

7. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.

8. Загрузить картриджи с образцами в прибор, установить наконечники, запустить программу экстракции РНК с лизисом образцов в приборе (O n board).

9. Дождаться, пока автоматическая станция NucliSENS easyMAG не остановит работу в положении Instrument State-Idle (приблизительно 15 мин).

10.В отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл смешать магнитную силику NucliSens и ВКО стерильными наконечниками с аэрозольным барьером (см. табл. 5).

11.Открыть крышку прибора и добавить в каждую ячейку отдельным наконечником по 20 мкл подготовленной смеси магнитной силики NucliSens и ВКО. Жидкость в каждой ячейке тщательно перемешать пипетированием с помощью дозатора отдельными наконечниками с фильтром на 1000 мкл.

12.Запустить на приборе программу продолжения экстракции РНК.

13.После окончания экстракции РНК, извлечь картриджи из прибора и не позднее 30 мин после окончания процедуры экстракции РНК провести реакцию ОТ-ПЦР.

Для длительного хранения препарат необходимо перенести в одноразовую пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес или не выше минус 68 °С в течение года.

ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб»