Г1. Экстракция из 1000 мкл образца плазмы

Порядок работы

1. Лизирующий раствор МАГНО-сорб и раствор для отмывки 5 прогреть при температуре 60 °С до полного растворения кристаллов.

2. Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок на 5 мл и одноразовых крышек (включая отрицательный и положительный контроли экстракции) и промаркировать их.

3. При экстракции РНК из 24 образцов:

- во флакон с лизирующим раствором МАГНО-сорб (70 мл) внести 280 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT, все содержимое пробирки с компонентом А (0,6 мл) и все содержимое пробирки с магнетизированной силикой (0,9 мл);

- закрыть крышку флакона и аккуратно перемешать переворачиванием 5-7 раз, избегая образования пены;

- внести в пробирки на 5 мл по 2,6 мл подготовленной смеси лизирующего раствора МАГНО-сорб, ВКО, компонента А и магнетизированной силики.

4. При экстракции РНК менее чем из 24 образцов:

- смешать в отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл ВКО ВИЧ-М-FRT, компонент А и магнетизированную силику из расчета на одну точку: 10 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT, 20 мкл компонента А и 30 мкл магнетизированной силики. При расчете необходимо учитывать запас – рассчитывать на одну точку больше, например:

Количество образцов для экстракции РНК	ВКО ВИЧ-М- FRT (мкл)	Компонент А (мкл)	Магнетизированная силика (мкл)
6	70	140	210
12	130	260	390
18	190	380	570

- внести в пробирки на 5 мл по 60 мкл подготовленной смеси ВКО ВИЧ-М- FRT, компонента А и магнетизированной силики;

- внести в пробирки на 5 мл по 2,6 мл лизирующего раствора МАГНО-сорб.

5. Добавить в каждую пробирку с лизирующим раствором 1 мл исследуемого образца плазмы, перемешать пипетированием и закрыть крышкой.

6. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1, ПК-2). Для этого в приготовленную пробирку ПКО-1 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную пробирку ПКО-2 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, перемешать пипетированием и закрыть крышкой.

7. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в пробирку с лизирующим раствором добавить 100 мкл ОКО, перемешать пипетированием, закрыть крышкой.

8. Поместить пробирки в термостат с температурой 60 °С на 10 мин.

9. Перенести пробирки в магнитный штатив на 6 мин.

10.Используя наконечники без фильтра на 1000 мкл, осторожно, по стенке пробирки отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Перенести пробирки в обычный штатив.

11.Добавить в пробирки по 700 мкл раствора для отмывки 5, пробирки закрыть крышкой.

12.Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл (включая отрицательный и положительные контроли экстракции) и промаркировать их.

13.Ресуспендировать магнитный носитель со стенок осторожным вортексированием, а затем пипетированием, и перенести всю жидкость в приготовленные пробирки на 1,5 мл. На вортексе осадить капли жидкости с крышок и стенок пробирок.

14.Переставить пробирки в магнитный штатив и инкубировать 2 мин.

15.Отобрать надосадочную жидкость и перенести пробирки в обычный штатив.

16.Добавить 700 мкл раствора для отмывки 5, ресуспендировать магнитный носитель, и повторить пп. 14-15.

17.Аналогично провести одну отмывку 700 мкл раствора для отмывки 6.

18.Добавить 200 мкл раствора для отмывки 7, перемешать, а затем коротко осадить капли на вортексе.

19.Переставить пробирки в магнитный штатив на 1 мин, затем отобрать надосадочную жидкость.

20.Высушить сорбент, оставив пробирки с открытыми крышками на магнитном штативе в течение 10 мин.

21.Добавить 50 мкл буфера для элюции и перемешать на вортексе.

22.Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 5 мин, через 2 мин перемешать на вортексе.

23.Коротко осадить капли на вортексе и переставить пробирки в магнитный штатив. Инкубировать 2 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК.

ВНИМАНИЕ! Отбор очищенных РНК для проведения реакции ОТ-ПЦР осуществляется не снимая пробирок с магнитного штатива.

РНК-пробы не рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарата необходимо, не захватывая сорбент, перенести надосадочную жидкость в стерильную пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес, или не выше минус 68 °С в течение года.

Г2. Экстракция из 200 мкл образца плазмы

Порядок работы

1. Лизирующий раствор МАГНО-сорб и раствор для отмывки 5 прогреть при температуре 60 °С до полного растворения кристаллов.

2. Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл (включая отрицательный и положительные контроли экстракции) и промаркировать их.

3. Смешать в отдельной стерильной пробирке на 1,5 мл ВКО ВИЧ-М-FRT, компонент А и магнетизированную силику из расчета на одну точку: 10 мкл ВКО ВИЧ-М- FRT, 10 мкл компонента А и 20 мкл магнетизированной силики. При расчете необходимо учитывать запас – рассчитывать на одну точку больше, например:

Количество образцов для экстракции РНК	ВКО ВИЧ-М- FRT (мкл)	Компонент А (мкл)	Магнетизированная силика (мкл)
6	70	70	140
12	130	130	260
18	190	190	380
24	250	250	500

4. Внести в пробирки по 40 мкл подготовленной смеси ВКО ВИЧ-М- FRT, компонента А и магнетизированной силики.

5. Внести в пробирки 900 мкл лизирующего раствора МАГНО-сорб.

6. Добавить в каждую пробирку с лизирующим раствором 200 мкл исследуемого образца плазмы и перемешать на вортексе.

7. Для каждой панели необходимо поставить положительные контроли (ПК-1 и ПК-2). Для этого в приготовленную пробирку ПКО-1 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-1-ВИЧ, а в приготовленную пробирку ПКО-2 с лизирующим раствором добавить 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО-2-ВИЧ, перемешать на вортексе.

8. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для этого в пробирку с лизирующим раствором добавить 100 мкл ОКО, перемешать на вортексе.

9. Поместить пробирки в термостат с температурой 60 °С на 10 мин.

10.На вортексе осадить капли жидкости с крышек и стенок пробирок, открыть крышки и перенести пробирки в магнитный штатив на 2 мин.

11.Осторожно, по внутренней стенке пробирки отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Перенести пробирки в обычный штатив.

12.Добавить в пробирки по 700 мкл раствора для отмывки 5.

13.Перемешать магнетизированную силику вортексированием, а затем осадить капли кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

14.Поставить пробирки в обычный штатив, открыть крышки и переставить в магнитный штатив. Инкубировать 2 мин.

15.Отобрать надосадочную жидкость и перенести пробирки в обычный штатив.

16.Повторить отмывку раствором для отмывки 5 (пп. 12-15).

17.Аналогично провести одну отмывку 700 мкл раствора для отмывки 6.

18.Добавить 200 мкл раствора для отмывки 7, перемешать, а затем осадить капли на вортексе. Поставить пробирки в обычный штатив и открыть крышки.

19.Переставить пробирки в магнитный штатив на 1 мин, затем отобрать надосадочную жидкость.

20.Высушить сорбент, оставив пробирки с открытыми крышками на магнитном штативе в течение 10 мин.

21.Добавить 50 мкл буфера для элюции и перемешать на вортексе.

22.Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 5 мин, через 2 мин перемешать на вортексе.

23.Коротко осадить капли на вортексе и переставить пробирки в магнитный штатив. Инкубировать 2 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК.

ВНИМАНИЕ! Отбор очищенных РНК для проведения реакции ОТ-ПЦР осуществляется не снимая пробирок с магнитного штатива.

РНК-пробы не рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарата необходимо, не захватывая сорбент, перенести надосадочную жидкость в стерильную пробирку и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес или не выше минус 68 °С в течение года.

Г3. Экстракция нуклеиновых кислот с помощью автоматической станции (например, с помощью роботизированной станции для дозирования жидкостей Xiril (Xiril AG, Швейцария)

Комплект реагентов «МАГНО-сорб» совместим с открытыми автоматическими станциями выделения нуклеиновых кислот, использующими принцип намагничивания сорбента для эффективного отделения его от растворов, используемых в процессе экстракции. В этом случае, программирование протокола экстракции осуществляется по инструкции изготовителя автоматической станции в соответствии с последовательностью этапов, объемами реактивов и продолжительностью инкубаций, описанных выше в пп. Г1 и Г2 для комплекта реагентов «МАГНО-сорб».

ПРИЛОЖЕНИЕ Д. Порядок работы при использовании комплектов для экстракции РНК, не входящих в состав данного набора реагентов (при работе с формой 5)

Заявленные аналитические характеристики набора реагентов при работе с формой 5 гарантируются только в случае экстракции РНК при помощи комплектов реагентов рекомендованных ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (см. также методические рекомендации по применению набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT»).

В случае, если коэффициент В для используемого комплекта реагентов/автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот не указан во вкладыше, прилагаемому к набору реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT», необходимо провести калибровку самостоятельно.

Калибровка необходима для определения коэффициента В и производится при первой постановке набора данной серии. Калибровка осуществляется один раз для каждой новой серии набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» и проводится на используемом для экстракции РНК комплекте реагентов/автоматической станции.

Для проведения калибровки необходимо при первой постановке набора реагентов данной серии провести анализ 5 дополнительных точек: дополнительный повтор ПКО-1, дополнительный повтор ПКО-2 и калибратор HIV -Q в трех повторах.

Подготовка калибратора HIV - Q к работе

1. Осадить на вортексе содержимое пробирки калибратор HIV - Q, аккуратно открыть крышку и, избегая распыления содержимого, добавить 400 мкл растворителя Q.

2. Плотно закрыть пробирку и оставить ее на 20 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая на вортексе.

3. После полного растворения осадить содержимое пробирки калибратор HIV -Q на вортексе в течение 3-5 с для сброса капель с крышки.

Калибровку необходимо проводить на используемом для экстракции РНК комплекте реагентов. Процедура экстракции РНК проводится в соответствии с инструкцией к комплекту реагентов/автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот. Обязательным условием является внесение ВКО в образцы или лизирующий раствор до начала экстракции в объеме 10 мкл на одну пробу.

В случае если экстракция РНК проводится из 100 мкл плазмы – внести по 100 мкл растворенного калибратора HIV -Q в три пробирки для экстракции нуклеиновых кислот.

В случае если экстракция РНК проводится из прочего объема плазмы (100-1000 мкл) – внести в три пробирки, подготовленные для экстракции РНК, по 100 мкл растворенного калибратора HIV -Q и довести растворителем Q объем образца до используемого объема экстракции нуклеиновых кислот (например: при экстракции из 1 мл внести – 100 мкл растворенного калибратора HIV -Q и 900 мкл растворителя Q).

После окончания экстракции РНК провести реакцию ОТ-ПЦР в соответствии с данной инструкцией.

Средние значения концентрации по каналам FAM и JOE/HEX полученные для трех повторов калибратора HIV -Q использовать в количественных расчетах для определения коэффициента В по следующей формуле:

Коэффициент B=

число копий кДНК ВКО (канал FAM) в калибраторе HIV -Q число копий кДНК ВИЧ (канал JOE/HEX)в калибраторе HIV -Q

x коэффициент C

Коэффициент С указан во вкладыше, прилагаемом к набору реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» данной серии.

ВНИМАНИЕ! Вычисленное значение коэффициента В должно укладываться в диапазон указанный во вкладыше, прилагаемом к набору реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» данной серии.

Вычисленное значение коэффициента В записать во вкладыш для данной серии набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» и использовать для расчета концентрации РНК ВИЧ в исследуемых и контрольных образцах (см. раздел «Анализ и учет результатов», а также методические рекомендации по применению набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).

Значения, вычисленные для ПКО-1 и ПКО-2, записать во вкладыш для данной серии набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT», найти среднее значение для ПКО-1 и среднее значение для ПКО-2. Установить диапазон допустимых значений для ПКО-1 и ПКО-2: от «вычисленное среднее значение»/3 до «вычисленное среднее значение» х 3. Например: вычисленные значения для двух повторов ПКО-1 = 500000 копий/мл и 700000 копий/мл, тогда среднее вычисленное значение ПКО-1 = 600000 копий/мл, а диапазон допустимых значений для ПКО-1 = 200000-1800000 копий/мл. Вычисленные значения диапазонов допустимых значений для ПКО-1 и ПКО-2 записать во вкладыш и использовать для контроля следующих постановок данной серии набора реагентов «АмплиСенс^® ВИЧ-Монитор-FRT» (см. раздел «Анализ и интерпретация результатов»).