Биотехнологическая способность получения

На практике для исследования кормов и продуктов питания в полевых условиях, условиях производственных и испытательных лабораторий требуются методы, позволяющие количественно и быстро исследовать большое число образцов на наличие микотоксинов, по возможности с наименьшими затратами сил и финансовых средств.

Всем этим характеристикам отвечают методы на основе иммунологических реакций. Коммерчески доступные иммунологические методы для анализа микотоксинов базируются на применении специфических моноклональных и поликлональных антител против определенных токсинов, и в целом делятся на:

метод на основе иммуноафинных колонок (ИАК, IAC);

иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) (таблица 1.3.1).

Таблица 1.3.1 Коммерчески доступные иммунологические методы анализа для микотоксинов

Обычно, иммуноафинные колонки фактически используются для очистки образца от матричных соединений и позволяют провести выделение и концентрирование определенного микотоксина.

Следующая за этим элюция токсина из ИАК позволяет провести количественное определение с использованием классических аналитических методов. В случае проведения иммуноферментного анализа, процедуры очистки обычно не столь интенсивны как при других аналитических методах. Гомогенат или экстракт образца, содержащий микотоксин, или непосредственно исследуется количественно, используя стандартный микротитровальный планшет или пробирочный анализ формата ИФА, или используется иммуноферментный мембранный тест для проведения качественного или полуколичественного определения наличия микотоксинов.

Другие методы по исследованию микотоксинов, использующие иммунологический подход, о которых сообщается в литературе, включают оптические и акустические биосенсоры, капиллярный электрофорез.

Образец, содержащий микотоксин, льют по иммуноафинной матрице. Образец с микотоксином фильтруется через матрицу и микотоксин связывается на шариках. Элюирующий буфер льют по матрице, и очищенный микотоксин вымывается в кювету для проб.

Рисунок 1.3.1 Принцип иммуноафинной очистки микотоксинов

Иммуноафинные колонки обычно используются для очистки исследуемого образца от сложных матриц и концентрации токсинов перед обнаружением и оценкой содержания микотоксина, используя ряд классических аналитических методов, таких как ВЭЖХ, газовая хроматография, масс-спектрометрия, флуорометрия, ВЭТСХ и ТСХ. Метод заключается во введении экстракта образца в колонку, содержащую иммуноафинную матрицу, содержащую твердую фазу (например, гранулы агарозы), к которой ковалентно присоединены антитела против микотоксина (рисунок 1.3.1). Молекула токсина, содержащаяся в образце, присоединяется к соответствующему иммобилизированному антителу.

Последующие шаги включают удаление несвязанных матричных компонентов и экстрагента, элюцию токсина, изменяя элюирующий состав и, наконец, обнаружение токсина, используя аналитические методы. Как альтернатива, микотоксин, связанный в колонке, может быть элюирован и непосредственно измерен флюорометрией, основанной на собственной флюоресценции микотоксинов.

Мембранный тест позволяет за короткий период времени (около 10-15 мин) дать ответ на вопрос: присутствуют ли в испытуемом образце микотоксины выше уровня предела чувствительности данного теста? То есть фактически это качественное определение наличия / отсутствия микотоксинов в пробе. Метод требует экстракции, фильтрации, очистки (через колонку) и разведения образца. Далее раствор наносится на мембрану сенсибилизированную моноклональными антителами, куда также добавляется ферментный конъюгат микотоксина. Если концентрация микотоксинов в образце превышает предел чувствительности теста, все антитела на поверхности связываются с ними и весь добавленный конъюгат удаляется на этапе отмывки. При добавлении бесцветного субстрата конъюгат на поверхности мембраны катализирует цветную реакцию, в результате которой на месте связывания конъюгата образуется цветное пятно. Окрашивание аналитической зоны мембраны говорит об отсутствии микотоксинов в образце.

Иммуноферментный анализ обычно используется для мониторинга наличия микотоксинов выше определенного уровня (или их отсутствия) в испытуемом образце. В настоящее время доступен ряд качественных, полуколичественных и количественных методов. Основываясь на результатах ИФА подозрительные образцы должны быть перепроверены классическими методами. Доступны различные варианты ИФА для анализа микотоксинов (например, мембранные тесты, микротитровальные планшеты и пробирочные методы). Как правило, метод ИФА основан на конкурентом анализе, который использует или связанные с ферментным конъюгатом микотоксины, или антитела против определенного анализируемого токсина (рисунок 1.3.2). Типичная последовательность реакций, используя готовые реактивы в формате микротитровального планшета следующие:

. ферментный конъюгат добавляется к экстракту испытуемого образца;

. смесь добавляется к соответствующим антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета (например, микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами);

. количество соединенного с токсином конъюгата, связываемое иммобилизированными антителами зависит от количества токсина в образце; чем выше количество токсина в образце, тем ниже будет количество ферментного конъюгата присоединившегося к антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета и наоборот;

. ферментативная активность связанного с поверхностными антителами конъюгата определяется добавлением соответствующего субстрата, что приводит к образованию окрашенных продуктов, концентрация которых обратно пропорциональна концентрации токсина в испытуемом образце.

Рисунок 1.3.2 Принцип конкурентного ИФА для определения микотоксинов

Можно провести анализ содержания микотоксинов в кормах с использованием иммуноферментного метода. Для исследования применим готовые тест-системы производства компании R-Biopharm, Германия. Этой компанией выпускается ряд наборов для количественного определения микотоксинов: афлатоксины В, G, М, зеараленон, охратоксин А, Т-2 токсин, дезоксиниваленол, фумонизин В1, цитринина. Следует отметить, что практически для всех перечисленных микотоксинов существуют варианты тест-систем для определения особо малых концентраций этих токсичных соединений с пределом чувствительности на уровне хроматографических методик (RIDASCREEN® Mycotoxins) (время инкубации 1-2 часа) и экспресс-методы, позволяющие определять практически такие же концентрации в течение 15-30 минут (RIDASCREEN® FAST Mycotoxins). Все методики прошли утверждение и могут использоваться в лабораториях, входящих в структуру Министерства сельского хозяйства и продовольствия.

Организация анализа микотоксинов в кормах и пищевых продуктах иммуноферментным методом возможна минимальными средствами и в самые короткие сроки. Простота эксплуатации и незначительная стоимость необходимого оборудования выгодно отличают иммуноферментный метод от классических методов анализа и делают его особенно привлекательным для лабораторий с ограниченными финансовыми возможностями.

Необходимо отметить, что при практически равных показателях пределов обнаружения методы иммуноферментного анализа являются более производительными и позволяют проводить избирательное исследование только подозрительных по ИФА образцов инструментальными методами. Например, методом ИФА один лаборант может провести исследование 10-100 образцов за одну рабочую смену, в то время как при использовании ВЭЖХ - только 1-10 проб. При этом на проведение иммуноферментного анализа затрачивается от 15 минут до 3 часов (пробоподготовка до 1 часа), а методом ВЭЖХ - 2-4 часа при 1-3-дневной пробоподготовке.