Методы анализа за основными показателями качества с описанием методик по определению содержания основных компонентов

В работе анализируются возможности различных методов лабораторного исследования содержания микотоксинов в кормах для подтверждения диагноза на микотоксикоз. Приводится сравнительная стоимостная характеристика инструментальных и экспресс-методов.

Микотоксины - нелетучие, сравнительно низкомолекулярные «вторичные» продукты обмена веществ микроскопических грибов, которые могут воздействовать на людей и животных. Эти соединения считают «вторичными» метаболитами, так как они не являются необходимым компонентом для роста и развития грибов. Функции микотоксинов до сих пор четко не установлены, но они, как полагают, играют роль в устранении других микроорганизмов, конкурирующих за тот же самый питательный субстрат. Предполагается, что они также помогают паразитическим грибам проникать в ткани хозяина1. Количество токсинов необходимое для получения неблагоприятного эффекта для здоровья разнится в зависимости от вида микотоксина, а также от иммунного статуса каждого животного или человека.

Нормируемые микотоксины продуцируются в основном грибами родов Aspergillus, Fusarium, Penicillium. Однако микотоксины выделяются и от многих других видов грибов при определенных условиях роста. Виды и количества продуцированных микотоксинов зависят от штамма гриба, условий роста, а также от наличия или отсутствия других микроорганизмов в той же среде обитания. Микотоксины накапливаются на спорах грибов, фрагментах клетки и субстратах (источники питания).

Присутствие токсинообразующих грибов на кормах или продуктах питания не должно автоматически связываться с контаминацией соответствующими микотоксинами, так как на этот процесс влияет множество факторов. И наоборот, видимое благополучие (т. е. отсутствие плесени на корме) совсем не гарантирует отсутствие его токсичности, так как грибы могли погибнуть при изменившихся условиях хранения, а большинство микотоксинов обладает повышенной стойкостью к условиям окружающей среды.

Микотоксины - очень важные грибковые метаболиты, которые представляют потенциальную угрозу здоровью животного и человека. Термин микотоксины охватывает широкую группу соединений весьма отличающихся по своему химическому строению (рисунок 13), а, следовательно, по оказываемому токсическому действию. Опасность для человека и животных, представляемая микотоксинами постоянно переоценивается. Для некоторых микотоксинов уже установлены максимально допустимые уровни2,4. Необходимость четкого определения вида и концентрации микотоксина, содержащегося в том или ином корме обуславливается также возможной контаминацией их несколькими микотоксинами одновременно, что не позволяет четко поставить диагноз на микотоксикоз, основываясь только на клинической картине. Исследование проб кормов, проводимое нами с 2003 года подтвердило, что, как правило (? 85-90 % случаев), в одном образце присутствует сразу несколько видов микотоксинов. Особенно это касается токсинов, продуцируемых грибами рода Fusarium. Исходя из изложенного, можно сделать вывод, что есть потребность в аналитических методах исследования гарантирующих, что корма и продукты питания не содержат микотоксины выше допустимых пределов.

В настоящее время существует ряд приборных методов количественного определения микотоксинов в кормах и продуктах питания. Наиболее распространенными из них в настоящее время являются методики с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ, TLC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC), газовой хроматографии (ГХ, GC), масс-спектрометрии (МС, MS) и их сочетаний.

Тонкослойная хроматография является хроматографической методикой, применяемой для разделения, оценки чистоты и идентификации органических соединений. Она основана на применении пластин с нанесенной неподвижной фазой и подвижной фазы (растворитель). Идентификация анализируемого вещества проводится при одновременном внесении на пластину экстракта образца и стандартных растворов с известной концентрацией. Различные соединения в смеси продвигаются по пластине с различной скоростью вследствие различия в закономерностях их разделения между мобильной жидкой и неподвижной фазами (рисунок 2.1). На этом принципе основано разделение веществ в смеси экстракта. Флуоресцирующие вещества выявляют в УФ-свете, все остальные - с помощью специфических реагентов.

Дальнейшее развитие метод получил под названием высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ, HPTLC). Уменьшение толщины слоя неподвижной фазы (до 100 мкм) и величины частиц (до 5 мкм), привело к лучшему разделению веществ за более короткий период времени.

Методы ТСХ доступны почти для всех микотоксинов. Обнаружение и специфическая идентификация разработана для каждого отдельного микотоксина, используя молекулярные свойства или реакции трансформации веществ.

Главные недостатки тонкослойной хроматографии:

малая производительность;

большинство образцов нуждается в этапах экстракции и очистки для удаления потенциальных помех и матричных соединений перед анализом;

концентрация анализируемого вещества должна быть в диапазоне 0,01-0,1 %;

использование токсичных и летучих веществ в качестве растворителя.

Рисунок 2.1 Тонкослойная хроматография

Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в области исследования микотоксинов главным образом используются для заключительного отделения матричных соединений и обнаружения интересующего анализируемого вещества. В настоящее время методы ВЭЖХ широко распространены из-за их превосходящих характеристик и надежности по сравнению с тонкослойной хроматографией. Методы ВЭЖХ были разработаны для большинства основных микотоксинов в зерновых культурах и другой сельскохозяйственной продукции. Большинство методов надежны и стабильны.

Метод ВЭЖХ основан на разделении анализируемого экстракта в неподвижной фазе хроматографической колонки (рисунок 2.2) (для анализа микотоксинов чаще используются колонки С8 и С18) и дальнейшей их идентификации и количественном определении с помощью специальных детекторов. Наиболее распространенными детекторами для анализа микотоксинов в настоящее время являются ультрафиолетовый и флюоресцентный. Пределы чувствительности методов ВЭЖХ с применением данных детекторов могут доходить до 1 мкг/кг образца. В литературе сообщалось о разработке методов ВЭЖХ для одновременного анализа нескольких микотоксинов. Особенно успешно таким образом анализируются трихотеценовые микотоксины, в частности трихотецены.

Рисунок 2.2 Жидкостная хроматография