Протоколы процедур для выполнения в лаборатории

Синтез направляющих РНК

1.Приготовить реакционную смесь:

Компоненты	Объем
Вода без нуклеаз	Х мкл
10Х реакционный буфер	1.5 мкл (0.75Х рабочая концентрация)
Нуклеотиды	1.5 мкл каждого (7.5 мМ финальная концентрация каждого)
ДНК-матрица	Х мкл (1 мкг)
Т7 РНК-полимераза	1.5 мкл
Общий объем реакции	20 мкл

 

2. Инкубировать пробирку при 37℃ в течение 4 часов, допускается увеличить время проведения реакции до 16 часов (в течение ночи).

Обработка ДНКазой для удаления ДНК-матрицы

Стандартные реакции обычно генерируют большие количества РНК в концентрациях до 10 мг/мл. В результате реакционная смесь становится достаточно вязкой. Обработку ДНКазой легче проводить после разбавления реакционной смеси.

1. Необходимо приготовить следующую реакционную смесь:

Компоненты	Объем
Р.с. после синтеза РНК	20 мкл
Вода без нуклиаз	68 мкл
10Х буфер ДНКазы I	10мкл
ДНКаза I	2 мкл
Общий объем реакции	100л

 

2. Далее смесь необходимо перемешать и инкубировать течение 15 минут при 37℃. После завершения реакции необходимо произвести очистку синтезированной РНК. (Euro Gene)

Протокол очистки РНК

Все этапы очистки (включая центрифугирование) проводятся при комнатной температуре (20-25°C). По возможности следует работать быстро. Центрифугирование проводят на скорости ≥ 8000g (≥ 10 000 об/мин.)

1. Довести объем образца РНК до 100 мкл стерильной деионизованной водой без РНКаз.

2. Добавить 350 мкл «Связывающего раствора для РНК», закрыть пробирку и тщательно перемешать смесь на вортексе.

3. Добавить 250 мкл 96% этилового спирта, закрыть пробирку и перемешать смесь переворачиванием пробирки.

4. Поместить спин-колонку в собирательную 2 мл пробирку. Перенести пробу в спинколонку. Центрифугировать 30 секунд. Выбросить собирательную пробирку с фильтратом.

5. Поместить спин-колонку в новую собирательную пробирку. Внести в спинколонку 500 мкл «Промывочного раствора для РНК» и центрифугировать 30 секунд. Выбросить собирательную пробирку с фильтратом.

6. Повторить пункт 4.

7. Центрифугировать спин-колонку в новой собирательной пробирке 5 минут, для полного удаления промывочного раствора и осушения фильтра колонки. Выбросить собирательную пробирку.

8. Поместить спин-колонку в новую микро-центрифужную пробирку на 1,5 мл.

9. Нанести в центр мембраны 15-30 мкл предварительно нагретой до 50℃ воды или «Элюирующего раствора» (при необходимости объем элюата можно увеличить). Центрифугировать 30 сек.

Очищенная РНК может быть сразу использована для дальнейшей работы. Все дальнейшие работы с препаратом следует вести на льду. Необходимо избегать избыточных циклов замораживания-размораживания образца.

Протокол процедур расщепления ДНК:

1.Приготовить реакционную смесь в для сборки рибонуклеопротеинового комплекса Cas9-РНК-гид (4 пробирки):

Компоненты	Объем
Вода без нуклеаз	20мкл
NEB буфер 3.1	3 мкл
300нМРНК-гида	3 мкл
1 мкМ Cas9нуклиазы	1 мкл
Общий объем реакции	27 мкл

 

2.Инкубировать 10 минут при 25℃.

3.Далее добавить 3 мкл ДНК фага в каждую пробирку (30нМ), тщательно перемешать пипетированием, при необходимости сбросить капли в микроцентрифуге.

Инкубировать при 37℃втечение 15 минут.

4.Добавить 1 мкл протеиназы К в каждый образец, тщательно перемешать и центрифугировать в микроцентрифуге. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.

5.Проанализировать ДНК фрагменты с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве контроля нанести в одну из лунок геля такое же количество ДНК субстрата.

Определение эффективности рестрикции

Способов проверки с помощью разгонки в камере электрофореза на агарозном геле.

Расщепление исследуемой Streptococcus pyogenes phage 315.3 ДНК in vitro с помощью нуклеазы Cas9 Streptococcus pyogenes синтезируемых на основе спейсерный последовательностей.

Для выполнения данного этапа эксперимента необходимо иметь два компонента: RNP комплекс Cas9-sgRNA и ДНК матрицу для таргетирования. В качестве матрицы можно использовать ампликон размером около 1000 п.н. Праймеры для его амплификации подбираются таким образом, чтобы в результате действия Cas9 образовывались два фрагмента разной длины, визуально легко детектируемые с помощью электрофореза в агарозном геле (например, 300 и 700 п.н. или 400 и 600 п.н.). После проведения реакции расщепления ДНК нуклеазой Cas9 реакционную смесь наносят на агарозный гель и проводят разделение ДНК фрагментов по длине с помощью электрофореза. По наличию или отсутствию полос, соответствующих продуктам разрезания, а также по соотношению интенсивности полос исходного фрагмента и продуктов делают вывод о работоспособности и эффективности выбранных направляющих РНК. (более подробное описание см ниже).

Рис 6. Визуализация результатов in vitro проверки sg-RNAs. По соотношению интенсивности свечения полос продуктов и исходного фрагмента можно сделать вывод, что sgRNA-3 обладает наибольшей эффективностью, а sgRNA-1 — наименьшей.

Ещё один способ проверить эффективность рестрикции можно путём проведения ПЦР фрагмента исследуемой ДНК в месте рестрикции. То есть необходимо воссоздать фрагмент данной ДНК, включающей место протоспейсера, а ткже около пятидесяти нуклеотидов слева и справа от него. Для его синтеза необходимо подобрать праймеры. В случаи его детекции после процедуры ПЦР в опытных образцах можно утверждать, что рестрикция не произошла, а следовательно, отсутствует РАМ. Если детекция не наблюдается, значит, данный участок был поврежден нуклеазой Сas 9, а следовательно не может быть восстановлен в результате ПЦР. В качестве контроля использовался восстановленный фрагмент без добавления Сas 9 sg-RNA комплекса.

Полимеразная цепная реакция с ДНК Streptococcus pyogenes phage 315.3

1. Подготовить в отдельной пробирке исходную смесь для постановки ПЦР на 6 пробы.

Компоненты	Объем на 1 пробу	Объем на 6 пробы
H2O	18 мкл	108 мкл
10х Taq буфер	2,5 мкл	15 мкл
dNTP	1 мкл	6 мкл
Праймеры F	1 мкл	6 мкл
Праймеры R	1 мкл	6 мкл
Taq полимераза	0,5 мкл	3 мкл

2. Перемешать реакционную смесь пипеткой, разлить ее по пробиркам для ПЦР и подписать пробирки (К-, К+, проба).

3. В пробирку с положительным контролем внести 1 мкл выданной геномной ДНК.

 4. В пробирку «проба» внести 1 мкл выделенной геномной ДНК.

5. Если в реакционной смеси наблюдаются пузырьки воздуха, эти образцы следует центрифугировать.

 6. Настроить программу амплификатора в соответствии с заданными параметрами:

72℃

Первичная денатурация ДНК	95℃	3 мин
Денатурация ДНК	95℃	30 сек	30 циклов
Отжиг праймеров	54℃	30 сек	30 циклов
Элонгация	72℃	40 сек	30 циклов
Финальная достройка	72℃	2 мин
Хранение	12℃	∞

7. Установить пробирки в амплификатор и запустить программу

Протокол процедуры Электрофорез в агарозном геле:

1. Опираясь на длину разделяемых/визуализированных фрагментов, определить процентное содержание агарозы в геле.

 2. Рассчитать необходимое количество компонентов для приготовления 150 мл агарозного геля выбранной процентности:

 ▪ агароза 3 г

▪ TAE-буфер 147 мл

▪ этидиум-бромид 6 мкл (из расчета 2 мкл на 50 мл геля)

3. Приготовить навеску агарозы, перенести в коническую колбу и добавить необходимый объем TAE-буфера.

 4. Расплавить агарозу в СВЧ-печи.

5. Остудить гель в течение 5 минут. В это время собрать конструкцию для заливки геля.

6. Добавить необходимый объем бромистого этидия, тщательно перемешать.

 7. Залить гель и подождать 20-30 мин до его полного застывания.

8. Провести расчет красителя, добавляемого к пробе, исходя из кратности (4х или 6х) и объема пробы.

▪ проба 24 мкл

▪ краситель 96 мкл

 ▪ итоговый объем 120 мкл

 9. Добавить краситель к пробам, тщательно перемешать образцы до равномерного распределения краски.

 10. Перенести застывший гель в электрофорезную камеру c учетом расположения полюсов в электрофорезной камере.

11. Перенести по 15 мкл проб в гель для электрофореза в следующем порядке: маркер длин ДНК фрагментов, отрицательный контроль, положительный контроль, проба с выделенной ДНК.

12. Запустить электрофорез.

 13. После завершения электрофореза сделать фотографию геля.

3. Список литературы

1. Анализ консенсусных последовательностей и визуализация. Электронный документ WebLogo3

2. База данных вирусных геномов. https://www.genome.jp/virushostdb/view/?mode=viewHYPERLINK "https://www.genome.jp/virushostdb/view/?mode=view&virus_scientific_name=Streptococcus+phage"&HYPERLINK "https://www.genome.jp/virushostdb/view/?mode=view&virus_scientific_name=Streptococcus+phage"virus_scientific_name=Streptococcus+phage

3. База данных для анализа CRISPR кассет. https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr

4. База данных для поиска нуклеотидных последовательностей. https://www.ncbi.nlm.nih.gov

5. Выравнивание и картирование последовательностей (Bowtie2) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml

6. Гоглева. А. А. И сследование CRISPR-систем прокариотического иммунитета методами сравнительной геномики. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, 03.01.09 - математическая биология, биоинформатика. 2016 г. 101 с.

7. Гребенкина Н.А., Андреюк Д.А. Генная инженерия. Тулкит. М.: Фонд новых форм развития образования, 2018 –148 с. Издание 2-е, переработанное и дополненное.

8. Гребенкина Н.А., Глазова О.В., Митяева О.Н., Андреюк Д.С. Практикум по геномному редактированию. М.: 2019. 40 с.

9. Дизайн генетических конструкций. http://ugene.net/ru

10. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под редакцией Вл. В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А. Романова. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2011 г. 487 с.

11. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas – инструменты открытий // ACTA NATURAE. 2014 г. Том 6. №3 (22) С. 20 – 42

12. Программа для построения праймеров. https://www.HYPERLINK "https://www.primer3.ut.ee/"primer3.ut.ee

13. Репозиторий генетических конструкций. http://www.addgene.org

14. Шмаков С.А. Разработка биоинформатического подхода для поиска новых CRISPR-Cas систем. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, 03.01.09 - математическая биология, биоинформатика. 2017 г. 104 с.

15. F. J. M. Mojica, C. Díez-Villaseñor, J. García-Martínez, and C. Almendros, “Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system.,” Microbiology, vol. 155, no. Pt 3, pp. 733–740, Mar. 2009.

16.  M. M. Harrison, B. V. Jenkins, K. M. O’Connor-Giles, and J. Wildonger, “A CRISPR view of development,” Genes Dev., vol. 28, no. 17, pp. 1859–1872, 2014.

17.  Tautvydas Karvelis, Giedrius Gasiunas, Joshua Young, Greta Bigelyte, Arunas Silanskas, Mark Cigan and Virginijus Siksnys. Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif sequence elements // Genome Biology. Article number: 253. Published: 19 November 2015. DOI 10.1186/s13059-015-0818-7 (https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-015-0818-7)