Современное состояние и перспективы развития биотехнологии

Современное состояние и перспективы развития биотехнологии

С древних времен известны отдельные биотехнологические процессы, используемые в сферах практической деятельности человека. К ним относятся хлебопечение, виноделие, пивоварение, приготовление кисломолочных продуктов и т. д. Наши предки не имели представления о сути процессов, лежащих в основе таких технологий, но в течение тысячелетий, используя метод проб и ошибок, совершенствовали их. Биологическая сущность этих процессов была выявлена лишь в XIX в. благодаря научным открытиям Л. Пастера. Его работы послужили основой для развития производств с использованием разнообразных видов микроорганизмов. В первой половине XX в. стали применять микробиологические процессы для промышленного получения ацетона и бутанола, антибиотиков, органических кислот, витаминов, кормового белка.

Успехи, достигнутые во второй половине XX в. в области цитологии, биохимии, молекулярной биологии и генетики, создали предпосылки для управления элементарными механизмами жизнедеятельности клетки, что способствовало бурному развитию биотехнологии. Благодаря селекции высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, эффективность биотехнологических процессов увеличилась в десятки и сотни раз.
Особенностью биотехнологии является то, что она сочетает в себе самые передовые достижения научно-технического прогресса с накопленным опытом прошлого, выражающимся в использовании природных источников для создания полезных для человека продуктов. Любой биотехнологический процесс включает ряд этапов:

подготовку объекта, его культивирование, выделение, очистку, модификацию и использование полученных продуктов. Многоэтапность и сложность процесса обусловливает необходимость привлечения к его осуществлению самых разных специалистов: генетиков и молекулярных биологов, цитологов, биохимиков, вирусологов, микробиологов и физиологов, инженеров-технологов, конструкторов биотехнологического оборудования и др.

Характеристика различных видов биотехнологической продукции и ее основные потребители.

Объекты, методы и продукты биотехнологии, их характеристика, цели применения в пищевой отрасли

Селекция продуцентов БАВ.

Неотъемлемым компонентом в процессе создания наиболее ценных и активных продуцентов, т.е. при подборе объектов в биотехнологии, является их селекция.

Выделение м/о из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала (берут пробы материала) и производят посев в селективную среду, т.е. получают накопительные культуры. Следующим этапом является выделение чистой культуры с дальнейшим изучением изолированного микроорганизма. Главным путем селекции является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента.

В развитии микробных технологий сыграли важную роль методы, базирующиеся на селекции спонтанно возникающих измененных вариантов, характеризующихся нужными полезными признаками. При таких методах обычно используется ступенчатая селекция: на каждом этапе отбора из популяции микроорганизмов отбираются наиболее активные варианты (спонтанные мутанты), из которых на следующем этапе отбирают новые, более эффективные штаммы.

Процесс селекции наиболее эффективных продуцентов значительно ускоряется при использовании метода индуцированного мутагенеза. В качестве мутагенных воздействий применяются УФ, рентгеновское и гамма-излучения, определенные химические вещества. Однако и этот прием также не лишен недостатков, главным из которых является его трудоемкость и отсутствие сведений о характере изменений.

Применение перечисленных подходов в сочетании с приемами классической селекции является сутью современной селекции микроорганизмов-продуцентов.

Продукты микробного синтеза

Антибиотики -- один из первых продуктов микробиологического синтеза, которые широко производят для медицины и сельского хозяйства. Большинство антибиотиков накапливается вне клеток микроорганизма-продуцента, которыми в основном являются Актиномицеты, некоторые грибы и бактерии, главным образом их мутантные формы. Антибиотические препараты, употребляемые преимущественно в медицине, отличаются высокой степенью чистоты. На корм животным чаще идёт концентрат среды после выращивания в ней продуцента, иногда вместе с биомассой, содержащий значительное количество др. продуктов обмена веществ продуцента, в том числе витамины, аминокислоты, нуклеотиды и т.п. Некоторые антибиотики (фитобактериомицин, трихотецин, полимиксин) используются как средства защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Витамины, провитамины, коферменты. Методом микробиологического синтеза производят в основном витамин B12, а частично и витамин B2 и его коферментную форму -- флавинадениндинуклеотид (ФАД), каротиноиды, эргостерин. Кроме того, развивается производство разных др. соединений этого типа (никотинамидные коферменты и др.). Витамин B12 получают практически только путём микробиологического синтеза. Основными продуцентами при этом служат пропионовокислые бактерии, актиномицеты, а также комплекс метанобразующих бактерий, использующих отходы бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) и применяемых в основном для получения кормового концентрата (высушенная среда с биомассой продуцента). Многие микроорганизмы способны к сверхсинтезу витамина B2 с активным выделением его в среду, но в качестве промышленных продуцентов употребляют наиболее активные культуры, главным образом грибы Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii. Помимо свободного витамина, при помощи Е. ashbyii получают также ФАД. в-каротин -- провитамин витамина А, получаемый также другими способами (извлечение из моркови и др. объектов, химический синтез), образуется наряду с другими каротиноидами многими микроорганизмами и содержится в клетках, придавая биомассе характерную окраску от жёлтой до красных тонов; однако наибольший практический интерес представляет культура Blakeslea trispora -- самый активный синтетик, которым и пользуются в основном в качестве продуцента при промышленном биосинтезе. Эргостерин -- провитамин витамина D2 -- содержится в клетках многих дрожжей; основным источником его промышленного получения служат пекарские дрожжи. Однако уже имеются дрожжевые культуры со значительно более высоким уровнем накопления эргостерина. Комплекс витаминов и коферментов синтезируется, кроме того, в процессе развития дрожжей и накапливается в дрожжевой биомассе, которая привлекает всё более пристальное внимание как источник этих соединений.

Ферменты, синтезируемые микроорганизмами, и создаваемые на их основе ферментные препараты приобрели большое значение в народном хозяйстве, особенно в пищевой промышленности. Продуцентами ферментов -- протеаз, амилаз, фосфатаз, целлюлаз, пектиназ, глюкозооксидазы, липаз, каталазы -- служат многие мицелиальные грибы, некоторые актиномицеты и бактерии. В зависимости от локализации фермента подвергают обработке микробную массу или фильтрат, свободный от микробных клеток. Получение чистых ферментных препаратов связано со значительными технологическими трудностями. Такие препараты обычно очень дороги; поэтому в промышленности используют комплексные препараты, содержащие, например, протеазы и липазы, протеазы и амилазы.

Аминокислоты. Наблюдаемый во многих странах недостаток ряда аминокислот в рационах человека и кормах животных вызвал промышленное их получение, в том числе и методом микробиологического синтеза. Существенное преимущество микробиологического синтеза аминокислот перед химическим методом заключается в получении их непосредственно в виде природных изомеров (L-формы). Из аминокислот наиболее важны Лизин и Глутаминовая кислота. Продуцентами аминокислот обычно служат культуры бактерий, относящихся к родам Brevibacterium и Micrococcus; для производства используются преимущественно мутанты-ауксотрофы, осуществляющие сверхсинтез соответствующей аминокислоты с выделением её в среду.

Нуклеотиды. Широкое развитие микробиологического синтеза нуклеотидов, в частности инозиновой, гуаниловой и др. кислот, получил в Японии, где они используются главным образом как добавки к специфическим продуктам восточной кухни. В будущем нуклеотиды приобретут, вероятно, более важное значение в качестве регуляторов многих энзиматических и гормональных процессов в животном организме. Накопление нуклеотидов происходит преимущественно в культуральной жидкости, т. е. вне клеток продуцентов. Для нуклеотидов, как и аминокислот, используются биохимические мутанты с выраженным сверхсинтезом нужного соединения.

Белок и белково-витаминные препараты. Особое значение как источник белка имеет микробная биомасса. Производство такой биомассы на дешёвом сырье рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в питании человека и животных. Наиболее интенсивное развитие получили промышленные методы синтеза так называемых кормовых дрожжей, применяемых в виде сухой биомассы как источник белка и витаминов в животноводстве. Кормовые дрожжи содержат значительном количество белка (до 50--55%), в состав которого входят незаменимые аминокислоты, например лизин, Триптофан, Метионин; они богаты витаминами, многими микроэлементами. Для выращивания кормовых дрожжей использовали преимущественно дешёвое углеводное сырьё -- гидролизаты отходов деревообрабатывающей промышленности, непищевых растительных материалов (подсолнечная лузга, стержни кукурузных початков и т.п.), сульфитные щелока, различные виды барды и т.д. Ныне в крупных промышленных масштабах организуется производство дрожжей на углеводородах (налканах, газойле, различных фракциях нефти). Большие запасы этого сырья позволяют планировать крупнотоннажное производство микробной биомассы. Для получения белково-витаминной биомассы изучается также возможность применения бактерий. Многие бактерии хорошо растут на углеводородах, в частности газообразных (например, на метане), а также на др. источниках углерода (например, на метаноле и уксусной кислоте). Углеводороды и их производные привлекают внимание и как сырьё для микробиологического синтеза отдельных физиологически активных соединений (аминокислот, витаминов, нуклеотидов и т.д.).

 

К числу продуктов микробного синтеза следует отнести и некоторые средства защиты растений: бактериальные энтомопатогенные препараты (например, энтобактерин, инсектин, дендробациллин), вызывающие гибель вредных насекомых и предотвращающие их массовое размножение. Указанное действие вызывают своеобразные «белковые кристаллы» -- носители токсичности, расположенные в микробных клетках.

 

11. Типовая схема получения ферментных препаратов различной степени очистки.

 

Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых веществ, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Процессы получения очищенных препаратов из поверхностных и глубинных культур несколько различны. Из поверхностных культур труднее получить высокоочищенные препараты из-за большого количества балластных веществ. Из глубинных культур получить очищенные препараты несколько легче, но при этом приходится вести выделение из разбавленных растворов, если выделение ферментов проводится из жидкой части культуры. Выделение осложняется, если фермент внутриклеточный, и тогда необходимо разрушать клетки микроорганизмов. Принципиальную схему выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов можно представить в виде следующей схемы. (рис.1.)

Рис.1. Схема выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов

Из схемы ясно, что экстракт из поверхностной культуры или фильтрат культуральной жидкости является исходным материалом для получения препаратов ферментов различной степени очистки. На первом этапе выделения отходом процесса является нерастворимая часть культуры – биошрот, содержащий нерастворимые включения среды и биомассу продуцента.

Далее в зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующего ему балласта схема очистки и получения ферментного препарата может включать различные приемы и методы, такие, как концентрирование, диализ, осаждение органическими растворителями, солями, гель-фильтрование, афинная хроматография, иммобилизация, сушка термолабильных материалов и т. д. Поэтому рассмотрим этапы получения ферментных препаратов.

Экстрагирование ферментов

Все ферменты являются водорастворимыми белками, поэтому наилучшим экстрагентом для них является вода. Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо подвергнуть механическому или автолитическому разрушению их клеточные стенки, обладающие высоким диффузионным сопротивлением. Оболочки мицелиальных нитей имеют меньшее диффузионное сопротивление, чем оболочки бактериальных и дрожжевых клеток, поэтому дезинтеграции культуры грибов не требуется.

Извлечение ферментов проводят как из влажных, так и из сухих поверхностных культур грибов. Сухая культура может храниться длительное время без потери активности ферментов, и из нее получают более концентрированные экстракты. Технологически это выгоднее, но при подсушивании культуры имеют место потери активности, и потому экстрагирование целесообразно вести из влажной культуры. При экстрагировании различные водорастворимые вещества извлекаются из культуры с неодинаковой скоростью, происходит их частичное фракционирование, удельная активность ферментов в экстракте повышается в 3,5 – 4 раза по сравнению с исходной культурой в результате отделения большой части веществ (до 75 %) с нерастворимым остатком – биошротом.

На полноту экстрагирования ферментов из культур оказывают влияние многие факторы: температура, рН, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого фермента, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и т. д.

Одновременно с ферментами экстрагируются многие другие соединения, и часто скорость извлечения балластных веществ больше скорости экстрагирования из культуры целевого фермента. Поэтому рациональнее пойти на некоторые потери фермента и закончить экстрагирование на оптимальном значении отношения активности фермента в экстракте к сумме извлекаемых веществ. Этот вопрос решается экспериментально для каждого вида продуцента.

Влиять на процесс экстрагирования с помощью такого фактора, как температура, практически невозможно, так как ферменты очень термолабильны и инактивируются даже при 35 – 40 °С (рис. 3). Кроме того, повышение температуры до 35 – 40 °С влечет за собой увеличение содержания сухого вещества в экстракте и уменьшение удельной ферментативной активности на 1 г сухого вещества, повышение опасности инфицирования экстрактов. Поэтому при проведении экстракции в заводских условиях стремятся подавить развитие микрофлоры путем максимального снижения температуры воды до 22 – 25 °С и применения антисептиков (формалин, бензол, толуол, хлороформ и др.). В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5 – 7.

 

Рис.3. Влияние температуры на процесс экстрагирования

Для получения концентрированных экстрактов при небольших потерях ферментов с биошротом необходимо применять специальные экстракционные установки. Ранее широко использовались диффузионные батареи (рис. 4). В них можно получить экстракт с содержанием сухого вещества от 7 до 14 % в зависимости от вида культуры, среды и величины отбора экстракта. Но эти установки для экстрагирования ферментов из поверхностной культуры имели сравнительно небольшую производительность, требовали больших затрат ручного труда, и в них наблюдались сравнительно большие потери активности.

Рис.4. Диффузные батареи

Более перспективным в этом отношении является экстрактор непрерывного действия фирмы «Ниро Атомайзер» (Япония), работающий под избыточным давлением (рис. 6). Экстрактор представляет собой наклонную цилиндрическую емкость, снабженную двумя шнеками, теплообменными рубашками и насосами. Культура через дозирующее устройство 5 подается внутрь цилиндра, а с противоположной стороны вводится растворитель (вода).

Рис.5. Экстрактор непрерывного действия фирмы «Ниро Атомайзер» (Япония)

Экстракт выходит из установки через самоочищающийся фильтр, а биошрот удаляется с противоположного конца. В случае необходимости, если ферменты экстрагируются не полностью, можно осуществлять двухступенчатое экстрагирование, увеличивая длительность процесса. Вторичный экстракт может быть использован в качестве растворителя для первой ступени экстрагирования. Общая продолжительность экстрагирования регулируется частотой вращения шнеков. Вторичный биошрот используется как компонент среды или после обеспложивания в кормопроизводстве.

Очистка целевого продукта

Эта стадия необходима при получении очищенного целевого продукта, например, ферментных препаратов степени очистки более двухкратной. Эта стадия приводит к росту себестоимости получаемого целевого продукта.

Для очистки ферментов применяют избирательную сорбцию (связывание) каолином, трифосфатом кальция, гидроксидом алюминия и другими адсорбентами. Таким образом проводят сорбцию либо фермента, либо балластных белков, которые затем разделяют центрифугированием. Фермент из сорбента отделяют раствором фосфатного буфера.

На последнем этапе продукт отделяют от примесей, концентрируют и стабилизируют. После стабилизации продукта в зависимости от того, каким должен быть конечный продукт: сухим или жидким, его обезвоживают или сразу упаковывают и отправляют на хранение и далее - потребителю.

 

13. Способы выращивания клеток растений.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

В 1922 году В. Роббинс и Котте независимо друг от друга показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений. В 30-60-е годы ХХ века благодаря работам большого числа ученых (Ф. Уайт, Р. Готре и других) число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, превысило 150.

Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки. С использованием изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.

В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, слияния изолированных протопластов и т. д. Такие исследования привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.

Биореакторы

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофи­зических, биохимических, физико-химических процессов и предполага­ет использование большого количества разнотипного оборудования, которое связано между собой материальными, энергетическими пото­ками, образующими технологические линии.

Основным аппаратурным элементом биотехнологического процесса является биореактор - ферментер (рис. 10). Биореакторы предназначе­ны для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы, син-

теза целевого продукта. Биореакторы изготавливают из высоколигиро-ванных марок стали, иногда из титана. Внутренняя поверхность биоре­актора должна быть отполирована.

Типовые ферментеры представляют собой вертикальные ёмкости различной вместимости (малые - от 1 до 10 л, многотоннажные - более 1000 л) с минимальным числом штуцеров и передающих устройств. В биореакторах должны быть обеспечены оптимальные гидродинамиче­ские и массообменные условия.

Ферментеры снабжены паровой рубашкой, мешалками, барботера-ми, стерилизующими воздушными фильтрами, отбойниками, обеспечи­вающими необходимые температурный, газовый режим, гидродинами­ческую обстановку в биореакторе (т.е. процессы массо- и теплообмена). В биореакторах имеются пробоотборцики для отбора проб культураль-ной жидкости в процессе биосинтеза. Могут быть и другие конструк­тивные особенности, учитывающие специфику биотехнологического процесса. Работа отдельных узлов контролируется измерительными приборами, фиксирующими как параметры технологического процесса, так и отдельные физико-химические показатели культивирования (тем­пературу стерилизации и культивирования, скорость вращения мешал­ки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразование, рН, еН, рО₂, рСО₂ среды).

Тип биореактора, чистота обработки внутренних стенок аппарата и отдельных его узлов, ёмкость, коэффициент заполнения, поверхность теплоотдачи, способ отвода тепла, тип перемешивающих, аэрирующих устройств, арматура и запорные приспособления, способ пеногашения, — далеко не полный перечень отдельных элементов, которые, в отдель­ности и во взаимосвязи, влияют на процесс культивирования микроор­ганизмов и клеток.

Биореакторы подразделяют на три основные группы (рис. 11):

1) реакторы с механическим перемешиванием;

2) барботажные колонны, через которые для перемешивания со­держимого пропускают воздух;

3) эрлифтныереакторы с внутренней или внешней циркуляцией; перемешивание и циркуляция культуральной среды в них обес­печивается потоком воздуха, за счет которого между верхним и нижним слоями культуральной среды возникает градиент плот­ности.

Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они по­зволяют легко изменять технологические условия и эффективно достав­лять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакто­рах воздух подают в культуральную среду под давлением через раз­брызгиватель - кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом

Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они по­зволяют легко изменять технологические условия и эффективно достав­лять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакто­рах воздух подают в культуральную среду под давлением через раз­брызгиватель - кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом цели используют мешалки - одну или несколько. Мешалки, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору и увеличи­вают время пребывания в культуральной среде. Эффективность распре­деления воздуха зависит от типа мешалки, числа оборотов, физико-химических свойств среды.

При интенсивном перемешивании культуральной среды происходит ее вспенивание, поэтому рабочий объем биореактора не превышает 70% общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена, и таким образом предотвращается потеря культуральной жидкости. В пенящейся жидко­сти условия аэрации лучше, чем в плотных растворах (при условии не­прерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, т.е. при исключе­нии нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости). Вме­сте с тем вспенивание может привести к переувлажнению фильтров в отверстиях, через которые воздух выходит из биореактора, уменьше­нию потока воздуха и к попаданию в ферментер посторонних микроор­ганизмов.

Конструктивные особенности барботажных колонн и эрлифтных биореакторов дают этим типам ферментеров некоторые преимущества перед реакторами с механическим перемешиванием. Барботажные ко­лонны более экономичны, так как перемешивание в них происходит восходящими потоками воздуха равномерно по всему объему. Отсутст­вие механической мешалки исключает один из путей проникновения в биореактор посторонних микроорганизмов. В барботажных биореакто­рах не возникает сильных гидродинамических возмущений (сдвигов слоев жидкости культуральной среды относительно друг друга).

Уменьшение сдвиговых факторов важно по следующим причинам: клетки рекомбинантных микроорганизмов менее прочны, чем нетрансформированные;

клетка отвечает на внешние воздействие уменьшением количе­ства синтезируемых белков, в том числе рекомбинантных; под влиянием сдвиговых эффектов могут изменяться физиче­ские и химические свойства клеток, что затрудняет дальнейшую работу с ними (ухудшаются условия выделения, очистка реком­бинантных белков).

В барботажных колоннах воздух подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора; по мере подъема мелкие пузырьки воздуха объединяются, что влечет неравномерное его распределение. Кроме того, подача воздуха под высоким давлением приводит к сильному пе-нообразованию.

В эрлифтных биореакторах воздух подают в нижнюю часть верти­кального канала. Поднимаясь, воздух увлекает за собой жидкость к верхней части канала, где расположен газожидкостный сепаратор (здесь частично выходит воздух). Более плотная деаэрированная жидкость опускается по другому вертикальному каналу ко дну реактора и процесс повторяется. Таким образом, в эрлифтном биореакторе культуральная среда вместе с клетками непрерывно циркулирует в биореакторе.

Эрлифтные биореакторы выпускаются в двух конструктивных вари­антах. В первом - реактор представляет емкость с центральной трубой, которая обеспечивает циркуляцию жидкости (реакторы с внутренней циркуляцией). У эрлифтного биореактора второго типа культуральная среда проходит через отдельные независимые каналы (реактор с внеш­ней системой циркуляции).

Эрлифтные биореакторы более эффективны, чем барботажные ко­лонны, особенно в суспензиях микроорганизмов с большей плотностью или вязкостью. Перемешивание в эрлифтных ферментерах более интен­сивно и вероятность слипания пузырьков минимальна.

Для стерилизации биореактора применяют пар под давлением. Внутри биореактора не должно быть «мертвых зон», недоступных для пара во время стерилизации. Стерилизации подлежат все клапаны, дат­чики, входные и выходные отверстия.

Стерильность обеспечивается и герметизацией биотехнологическо­го оборудования, работающего в асептических условиях. Стерильная передача жидкости осуществляется через штуцеры парового затвора. Технологическая обвязка биореактора исключает контаминацию куль-туральной жидкости посторонней микрофлорой и возможности попада­ния продуктов биосинтеза в окружающую среду. Основные агенты, контаминирующие клеточные культуры — бактерии, дрожжи, грибы, простейшие, микоплазмы, вирусы. Источники контаминации - воздух, пыль, питательные среды, рабочие растворы, оборудование, рабочий персонал.

14 Требования к проведению отдельных процессов в стерильных условиях с аэрацией культур.1

Методы, применяемые для исключения возможности попадания в культуру посторонней микрофлоры, основаны либо на задержке, либо на уничтожении микроорганизмов (рис. 6.1).

Рис. 6.1. Способы обеспечения асептических условий

К методам, основанным на первом принципе, можно отнести стерилизующую фильтрацию воздуха и жидкостей (растворов питательных веществ), а также герметизацию технологического оборудования и коммуникаций. К методам, основанным на уничтожении микроорганизмов, относятся термическая, химическая и радиационная стерилизации (ионизирующее излучение). В биотехнологии наиболее распространена термическая стерилизация. Она применяется для стерилизации оборудования и коммуникаций, питательных сред и технологических растворов, для создания тепловых барьеров, препятствующих прониканию микроорганизмов в аппарат во время отбора проб, внесения посевного материала и добавок. В качестве стерилизующего агента при термической стерилизации обычно используют насыщенный водяной пар различного давления и температуры. Химическую стерилизацию применяют обычно для тех элементов оборудования, которые не выдерживают нагревания до температуры 110—130 °С, необходимой для тепловой стерилизации (некоторые датчики и другие средства

КИПиА, фильтры для воздуха и жидкостей). В качестве агентов химической стерилизации используют формальдегид, оксид этилена, Р-пропиолактон и др.

Радиационная стерилизация основана на губительном воздействии ионизирующего излучения на клетки микроорганизмов. Она пока не нашла широкого применения в микробиологической промышленности.

 

16. Методы стерилизации питательных сред.Основываясь на влиянии внешних условий на микроорганизмы, в микробиологической практике разра­ботан ряд приемов, приводящих микроорганизмы к гибе­ли. Одним из таких приемов является стерилизация.

Под стерилизацией (обеспложиванием) понимают пол­ное уничтожение микро­орга­низмов и их спор в питатель­ных средах, посуде, на инструментах и других предме­тах лабораторного оборудования. Для их стерильности наиболее часто пользуются воз­действием высокой тем­пературы.

 

Рис. 14

Значение температуры в разных
участках пламени газовой горелки

 

СТЕРИЛИЗАЦИЯ КИПЯЧЕНИЕМ

Стерилизацию металлических инструментов и резиновых трубок проводят кипячением. Так как споры некоторых бактерий сохраняют жизнеспособность при кипячении в воде в течение нескольких часов, то реко­мендуется стерилизацию кипячением проводить в 2%-ном растворе карбоната натрия в течение 10 мин. В этих усло­виях споры погибают.

 

СТЕРИЛИЗАЦИЯ СУХИМ ЖАРОМ

Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду. При этом пробирки, колбы предва­рительно закрывают ватными пробками. Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, их перед стерилиза­цией заворачивают в оберточную бумагу и вынимают толь­ко перед работой.

Пипетки перед стерилизацией с концов закрывают ва­той. Затем их обертывают длинными полосками бумаги шириной 3,5–4 см. Бумагу наматывают по спирали, на­чинная с конца пипетки, который будет погружен в среду. Концы обертки закрепляют ниткой. Тонкие пипетки обер­тывают бумагой вместе по несколько штук.

Чашки Петри заворачивают в бумагу в форме квадра­та, сторона которого приблизительно равна трем диамет­рам чашки. Чашку Петри помещают на середину листа, загибают его с двух противоположных сторон кверху так, чтобы края налегали друг на друга. Два свободных конца загибают вниз. При таком обертывании у чашек легко раз­личать верх и низ.

Подготовленную таким образом посуду помещают в су­шильный шкаф, в котором нагревают ее при температуре 160–170°С в течение 2 ч (с момента установления нужной температуры). При таком нагревании погибают не только бактерии, но и их споры.

Температуру в сушильном шкафу выше 175°С допус­кать не следует, так как при этом ватные пробки буреют, а бумажная обертка становится ломкой.

 

ПАСТЕРИЗАЦИЯ

В основе пастеризации лежит нагревание жид­костей до температуры меньше 100°С. Целью ее является уничтожение неспороносных бактерий в жидкостях, те­ряющих питательные свойства при кипячении (молоко, пиво, вино и др.). Осуществляется пастеризация путем нагревания жидкостей при 60°С в течение 30 мин, или при 75°С в течение 15 мин, или при 80°С в течение 10 мин.

 

ХОЛОДНАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ

Органические жидкости, не выносящие нагрева­ния, освобождают от бактерий, пропуская через стерильные мелкопористые фильтры. Эти фильтры задерживают мик­роорганизмы, их называют бактериальными фильтрами.

Бактериальные фильтры имеют разные номера. Фильт­ры № 1 имеют средний диаметр пор 0,3 мкм и являются наиболее надежными. Фильтры № 5 имеют самые боль­шие отверстия пор, диаметром 1,2 мкм.

Перед употреблением мембранные фильтры стерили­зуют кипячением. Фильтры помещают в теплую дистил­лированную воду и кипятят 30 мин, меняя 2– 3 раза воду.

 

Рис. 15

Устройство автоклавов:

а – вертикальный автоклав: 1 – подставка, 2 – водомерная трубка, 3 – ворон­ка, 4 – предо­хранительный клапан, 5 – манометр, 6 – крышка, 7 – винтовые зажимы, 8 – котел, 9 – кожух, 10 – камера стерилизации, 11 – водопаровая камера, 12 – паровыпускной клапан;

б – горизонтальный автоклав: 1 – поста­мент, 2 – нагревательный элемент. 3 – крышка котла, 4 – предохранительный клапан, 5 – вентиль, 6 – кожух, 7 – паровая камера, 8 – стерилизационная камера, 9 – манометр паровой камеры, 10 – трехходовой кран, 11 – сифонная трубка паровой камеры, 12 – опорное кольцо, 13 – крышка паровой камеры, 14 – штурвал, 15 – впускной кран,
16 – манометр котелка, 17 – трехходовой кран котелка, 18 – сифонная трубка котелка, 19 – патру­бок, 20 – воронка, 21 – водоуказательная колонка, 22 – котелок.

Крышку автоклава привинчивают болтами к корпу­су. Завинчивают болты попарно, крест-накрест, чтобы избежать перекоса крышки, который может возникнуть при завинчивании болтов по кругу.

Открывают краны и включают источник обогрева. Ко­гда пар из выпускного крана начинает выходить непрерыв­ной струей, его закрывают и наблюдают за постепенным повышением давления в рабочей камере по манометру.

Отсчет времени стерилизации начинают с того момен­та, когда в автоклаве установится заданное давление.

Таблица 5

Стадия выделения продукта существенно зависит от того, накапливается продукт в клетках или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Разделение биомассы и культуральной жидкости – сепарация – осуществляется несколькими методами.

Выделение биомассы. Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы).

Фильтрация – простой и широко применяемый процесс разделения твердых частиц и жидкости, скорость которого зависит от пористости фильтрующего материала и давления. Фильтрование при помощи вакуумных насосов существенно ускоряет процесс.

Флотирование применимо для выделения дрожжевых клеток. Процесс флотирования клеток осуществляется путем вспенивания культуральной жидкости. Вместе с пеной из культуральной жидкости удаляется и основная масса дрожжей.

Сепарирование осуществляют в сепараторах, в которых на клетки действует центробежная сила, отбрасывающая клетки к периферии сосуда, а культуральная жидкость будет собираться в центре сепаратора. Этот процесс протекает гораздо быстрее, чем отстаивание клеток под действием силы тяжести.

К физическим методам можно отнести разрушение клеток под действие ультразвука, замораживания-оттаивания, баллистическую дезинтеграцию. Баллистическая дезинтеграция клеток осуществляется в мельниц<