Типовые схемы получения основных продуктов микробного синтеза.

Обобщенная технологическая схема процесса микробного синтеза

Технологические процессы, базирующиеся на микробном синтезе, можно представить в виде определенной последовательности стадий, причем большинство из них общие для любого микробиологического производства (рис. 4.4): приготовление посевного материала; приготовление и стерилизация питательных сред; ферментация; выделение целевого продукта и получение его препаративной формы. Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций: стерилизацию оборудования и коммуникаций, приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др.

Рис. 4.4. Схема типового микробиологического производства

В промышленных условиях питательные среды обычно готовят в отдельном цехе, обеспечивающем потребности всех основных цехов завода. Среды готовят в емкостях, снабженных механическими мешалками, добавляя в определенной последовательности растворимые (сахара, минеральные соли, кукурузный экстракт) и нерастворимые (соевая мука, кукурузная мука, мел) компоненты. При необходимости отдельные компоненты подвергают дополнительной обработке: измельчению, просеиванию, отвариванию, экстрагированию и т.д.; крахмалсодержащее сырье клейстеризуют. Для лучшего растворения компонентов среду нагревают до 70—80 °С острым паром.

При приготовлении питательных сред для глубинного культивирования особое внимание уделяют их тщательной гомогенизации. Твердые частицы нерастворимых компонентов должны быть достаточно мелкими, это облегчает их потребление микроорганизмами и обеспечивает надежность стерилизации, так как крупные частицы медленнее прогреваются, резко повышается вероятность сохранения в них посторонней микрофлоры, особенно при непрерывной стерилизации.

Приготовленную питательную среду передают в цех ферментации, стерилизуют в установках непрерывной стерилизации (УНС) и заполняют ею предварительно простерилизованные ферментёры. В некоторых случаях среду стерилизуют непосредственно в ферментёре (обычно при небольших объемах среды).

Для засева промышленного ферментёра необходимо достаточно большое количество посевного материала (обычно 5—10% объема ферментационной среды). Его выращивают в несколько стадий. Исходную музейную культуру продуцента, поступающую с посевной станции, выращивают в пробирках на скошенных агаризованных питательных средах. Полученную культуру смывают с поверхности твердой среды стерильной водой и переносят в колбы Эрленмейера («маточные» колбы), заполненные 50—100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы устанавливают на качалку и выращивают в течение 18—48 ч при поддержании температуры, оптимальной для данного продуцента. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования. Как правило, наиболее пригодна для дальнейшего использования посевная культура, развитие которой находится в конце логарифмической фазы роста. При необходимости получения относительно больших количеств посевного материала его выращивают в 2—3 стадии.

Выращенным материалом засевают посевной аппарат (иноку-лятор), загруженный предварительно простерилизованной питательной средой, где процесс роста культуры продолжается. В ходе культивирования осуществляют аэрацию и перемешивание среды, регулирование температуры, pH, пеногашение. Количество стадий выращивания посевного материала в аппаратах может быть различным и зависеть от объема основных ферментеров и расхода посевного материала. Как правило, используют инокуляторы объемами 0,10; 0,63; 2,00; 5,00 и 10,00 м³. На всех этапах выращивания контролируют качество посевного материала (в основном по морфологическим признакам) и отсутствие в нем посторонней микрофлоры. Полученный на последней стадии вегетативный посевной материал передается в ферментёр. Описанные выше подготовительные стадии микробиологического процесса рассмотрены для культур, выращиваемых в глубинных условиях. При поверхностном культивировании подготовительные операции в принципе те же, но режимы и оборудование для их проведения совершенно другие.

Продукты микробного синтеза

Антибиотики -- один из первых продуктов микробиологического синтеза, которые широко производят для медицины и сельского хозяйства. Большинство антибиотиков накапливается вне клеток микроорганизма-продуцента, которыми в основном являются Актиномицеты, некоторые грибы и бактерии, главным образом их мутантные формы. Антибиотические препараты, употребляемые преимущественно в медицине, отличаются высокой степенью чистоты. На корм животным чаще идёт концентрат среды после выращивания в ней продуцента, иногда вместе с биомассой, содержащий значительное количество др. продуктов обмена веществ продуцента, в том числе витамины, аминокислоты, нуклеотиды и т.п. Некоторые антибиотики (фитобактериомицин, трихотецин, полимиксин) используются как средства защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Витамины, провитамины, коферменты. Методом микробиологического синтеза производят в основном витамин B12, а частично и витамин B2 и его коферментную форму -- флавинадениндинуклеотид (ФАД), каротиноиды, эргостерин. Кроме того, развивается производство разных др. соединений этого типа (никотинамидные коферменты и др.). Витамин B12 получают практически только путём микробиологического синтеза. Основными продуцентами при этом служат пропионовокислые бактерии, актиномицеты, а также комплекс метанобразующих бактерий, использующих отходы бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) и применяемых в основном для получения кормового концентрата (высушенная среда с биомассой продуцента). Многие микроорганизмы способны к сверхсинтезу витамина B2 с активным выделением его в среду, но в качестве промышленных продуцентов употребляют наиболее активные культуры, главным образом грибы Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii. Помимо свободного витамина, при помощи Е. ashbyii получают также ФАД. в-каротин -- провитамин витамина А, получаемый также другими способами (извлечение из моркови и др. объектов, химический синтез), образуется наряду с другими каротиноидами многими микроорганизмами и содержится в клетках, придавая биомассе характерную окраску от жёлтой до красных тонов; однако наибольший практический интерес представляет культура Blakeslea trispora -- самый активный синтетик, которым и пользуются в основном в качестве продуцента при промышленном биосинтезе. Эргостерин -- провитамин витамина D2 -- содержится в клетках многих дрожжей; основным источником его промышленного получения служат пекарские дрожжи. Однако уже имеются дрожжевые культуры со значительно более высоким уровнем накопления эргостерина. Комплекс витаминов и коферментов синтезируется, кроме того, в процессе развития дрожжей и накапливается в дрожжевой биомассе, которая привлекает всё более пристальное внимание как источник этих соединений.

Ферменты, синтезируемые микроорганизмами, и создаваемые на их основе ферментные препараты приобрели большое значение в народном хозяйстве, особенно в пищевой промышленности. Продуцентами ферментов -- протеаз, амилаз, фосфатаз, целлюлаз, пектиназ, глюкозооксидазы, липаз, каталазы -- служат многие мицелиальные грибы, некоторые актиномицеты и бактерии. В зависимости от локализации фермента подвергают обработке микробную массу или фильтрат, свободный от микробных клеток. Получение чистых ферментных препаратов связано со значительными технологическими трудностями. Такие препараты обычно очень дороги; поэтому в промышленности используют комплексные препараты, содержащие, например, протеазы и липазы, протеазы и амилазы.

Аминокислоты. Наблюдаемый во многих странах недостаток ряда аминокислот в рационах человека и кормах животных вызвал промышленное их получение, в том числе и методом микробиологического синтеза. Существенное преимущество микробиологического синтеза аминокислот перед химическим методом заключается в получении их непосредственно в виде природных изомеров (L-формы). Из аминокислот наиболее важны Лизин и Глутаминовая кислота. Продуцентами аминокислот обычно служат культуры бактерий, относящихся к родам Brevibacterium и Micrococcus; для производства используются преимущественно мутанты-ауксотрофы, осуществляющие сверхсинтез соответствующей аминокислоты с выделением её в среду.

Нуклеотиды. Широкое развитие микробиологического синтеза нуклеотидов, в частности инозиновой, гуаниловой и др. кислот, получил в Японии, где они используются главным образом как добавки к специфическим продуктам восточной кухни. В будущем нуклеотиды приобретут, вероятно, более важное значение в качестве регуляторов многих энзиматических и гормональных процессов в животном организме. Накопление нуклеотидов происходит преимущественно в культуральной жидкости, т. е. вне клеток продуцентов. Для нуклеотидов, как и аминокислот, используются биохимические мутанты с выраженным сверхсинтезом нужного соединения.

Белок и белково-витаминные препараты. Особое значение как источник белка имеет микробная биомасса. Производство такой биомассы на дешёвом сырье рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в питании человека и животных. Наиболее интенсивное развитие получили промышленные методы синтеза так называемых кормовых дрожжей, применяемых в виде сухой биомассы как источник белка и витаминов в животноводстве. Кормовые дрожжи содержат значительном количество белка (до 50--55%), в состав которого входят незаменимые аминокислоты, например лизин, Триптофан, Метионин; они богаты витаминами, многими микроэлементами. Для выращивания кормовых дрожжей использовали преимущественно дешёвое углеводное сырьё -- гидролизаты отходов деревообрабатывающей промышленности, непищевых растительных материалов (подсолнечная лузга, стержни кукурузных початков и т.п.), сульфитные щелока, различные виды барды и т.д. Ныне в крупных промышленных масштабах организуется производство дрожжей на углеводородах (налканах, газойле, различных фракциях нефти). Большие запасы этого сырья позволяют планировать крупнотоннажное производство микробной биомассы. Для получения белково-витаминной биомассы изучается также возможность применения бактерий. Многие бактерии хорошо растут на углеводородах, в частности газообразных (например, на метане), а также на др. источниках углерода (например, на метаноле и уксусной кислоте). Углеводороды и их производные привлекают внимание и как сырьё для микробиологического синтеза отдельных физиологически активных соединений (аминокислот, витаминов, нуклеотидов и т.д.).

К числу продуктов микробного синтеза следует отнести и некоторые средства защиты растений: бактериальные энтомопатогенные препараты (например, энтобактерин, инсектин, дендробациллин), вызывающие гибель вредных насекомых и предотвращающие их массовое размножение. Указанное действие вызывают своеобразные «белковые кристаллы» -- носители токсичности, расположенные в микробных клетках.

11. Типовая схема получения ферментных препаратов различной степени очистки.

Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых веществ, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Процессы получения очищенных препаратов из поверхностных и глубинных культур несколько различны. Из поверхностных культур труднее получить высокоочищенные препараты из-за большого количества балластных веществ. Из глубинных культур получить очищенные препараты несколько легче, но при этом приходится вести выделение из разбавленных растворов, если выделение ферментов проводится из жидкой части культуры. Выделение осложняется, если фермент внутриклеточный, и тогда необходимо разрушать клетки микроорганизмов. Принципиальную схему выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов можно представить в виде следующей схемы. (рис.1.)

Рис.1. Схема выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов

Из схемы ясно, что экстракт из поверхностной культуры или фильтрат культуральной жидкости является исходным материалом для получения препаратов ферментов различной степени очистки. На первом этапе выделения отходом процесса является нерастворимая часть культуры – биошрот, содержащий нерастворимые включения среды и биомассу продуцента.

Далее в зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующего ему балласта схема очистки и получения ферментного препарата может включать различные приемы и методы, такие, как концентрирование, диализ, осаждение органическими растворителями, солями, гель-фильтрование, афинная хроматография, иммобилизация, сушка термолабильных материалов и т. д. Поэтому рассмотрим этапы получения ферментных препаратов.