L-формы бактерий. Морфология микоплазм и других молликут.

Под действием ряда факторов, неблагоприятно действующих на бактериальную клетку (антибиотики, ферменты, антитела и др.), происходит L-трансформация бактерий, приводящая к постоянной или временной утрате клеточной стенки. L-трансформация является не только формой изменчивости, но и приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования. В результате изменения антигенных свойств (утрата О- и К-антигенов), снижения вирулентности и других факторов L-формы приобретают способность длительно находиться (персистировать) в организме хозяина, поддерживая вяло текущий инфекционный процесс. Утрата клеточной стенки делает L-формы нечувствительными к антибиотикам, антителам и различным химиопрепаратам, точкой приложения которых является бактериальная клеточная стенка. Нестабильные L-формы способны реверсировать в классические (исходные) формы бактерий, имеющие клеточную стенку. Имеются также стабильные L-формы бактерий, отсутствие клеточной стенки и неспособность реверстровать которых в классические формы бактерий закреплены генетически. Они по ряду признаков очень напоминают микоплазмы и другие молликуты - бактерии, у которых клеточная стенка отсутствует как таксономический признак. Микроорганизмы, относящиеся к микоплазмам -самые мелкие прокариоты, не имеют клеточной стенки и как все бактериальные бесстеночные структуры имеют сферическую форму.

Микоплазмы (семейство Mycoplasmacea, класс Mollicutes) не способны синтезировать компоненты клеточной стенки. Вместо неё микоплазмы покрыты трехслойной эластичной мембраной, состоящей из липопротеиновых соединений, фосфолипидов с включением стеринов, которых нет у бактерий и риккетсий. Содержат большое количество белка и нуклеиновых кислот; количество углеводов варьирует.

Большинство из них – факультативные анаэробы. Так как микоплазмы не имеют ригидной оболочки, они очень полиморфны. В мазках из культур обнаруживаются различные микроструктуры: гранулы, в виде крошечных кокков и элементарных телец; крупные шары; кольца; палочки, нити и ветвящиеся мицелиальные формы; аморфные массы, меняющиеся в конфигурации. Размеры микоплазм варьируют от 125–250 нм у мелких гранулярных форм до 0,4 –150 мкм у нитевидных структур. Микоплазмы не образуют жгутиков, капсул и спор. По Граму окрашиваются отрицательно, лучше окрашиваются по Романовскому–Гимзе. Размножаются путем бинарного деления, некоторые способны к почкованию и сегментации.Колонии мелкие с приподнятым центром («яичница глазунья»), врастают в среду. На поверхности колоний располагаются крупные, часто вакуолизированные клетки, в глубине – мелкие, оптически плотные организмы. Методы микроскопии. В световом микроскопе можно обнаружить лишь самые большие формы и виды микоплазм, размеры которых превышают 0,2 мкм в длину и в поперечнике. В живом состоянии их изучают в темном поле и фазово–контрастном микроскопе, ультраструктурные элементы выявляют при электронной микроскопии.

13. Споры и спорообразование у бактерий, методы выявления спор. Жгутики, методы выделения.

Споры – это особые формы существования некоторых бактерий при неблагоприятных условиях внешней среды. При попадании споры в благоприятные условия она прорастает в вегетативную форму.

Спорообразующие аэробные бактерии – бациллы, анаэробные – клостридии.

Расположение спор:

- центральное – размер споры не превышает поперечника клетки, возбудитель сибирской язвы; – субтерминальное – ближе к концу клетки и превышает ширину клетки, возбудитель ботулизма; - терминальное – на конце клетки, возбудитель столбняка.

Спорообразование - способ сохранения определенных видов бактерий в неблагоприятных условиях среды. Эндоспоры образуются в цитоплазме, представляют собой клетки с низкой метаболической активностью и высокой устойчивостью (резистентностью) к высушиванию, действию химических факторов, высокой температуры и других неблагоприятных факторов окружающей среды. Высокая резистентность связана с большим содержанием кальциевой соли дипиколиновой кислоты в оболочке спор. Основные фазы “жизненного цикла” спор - споруляция (включает подготовительную стадию, стадию предспоры, образования оболочки, созревания и покоя) и прорастание, заканчивающееся образованием вегетативной формы. Процесс спорообразования генетически обусловлен.

Стадии споруляции (процесс спорообразования):

1.) Конденсация и отделение септой нуклеоида. 2.) Обрастание цитоплазматической мембраной протопласта. 3.) Образование предспоры, окружённой второй оболочкой цитоплазматической мембраны. 4.) Формирование кортекса. 5.) Образование наружной и внутренней оболочек и экзоспориума.

При световой микроскопии часто используют метод выявления спор по Ожешко. Методика окраски по Ожешко:

1.) На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин. 2.) Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.

Окраска по Цилю-Нильсену:

1.) На фиксированный мазок нанести карболовый фуксин Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 минут. 2.) Снять бумагу, промыть препарат водой. 3.) Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси 96º этилового спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин. Для обесцвечивания. 4.) Промыть водой. 5.) Докрасить препарат водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин. 6.) Промыть водой. Высушить.

Жгутики. Подвижные бактерии могут быть скользящие (передвигаются по твердой поверхности в результате волнообразных сокращений) или плавающие, передвигающиеся за счет нитевидных спирально изогнутых белковых (флагеллиновых по химическому составу) образований - жгутиков.

По расположению и количеству жгутиков выделяют ряд форм бактерий:

1.) Монотрихи - имеют один полярный жгутик.2.) Лофотрихи - имеют полярно расположенный пучок жгутиков.3.) Амфитрихи - имеют жгутики по диаметрально противоположным полюсам.4.) Перитрихи - имеют жгутики по всему периметру бактериальной клетки.

Способность к целенаправленному движению (хемотаксис, аэротаксис, фототаксис) у бактерий генетически детерминирована.

Функции жгутиков:

1.) Обеспечивают адгезию — начальную стадию инфекционного процесса.2.) Обеспечивают подвижность бактерий.3.) Определяют антигенную специфичность, это Н-антиген.

Выявление жгутиков:

1.) Фазовоконтрастная микроскопия нативных препаратов («раздавленной» и «висячей» капли). Микроскопически подвижность определяют у клеток суточной культуры. Для того чтобы отличить подвижность от пассивного броуновского движения, к капле исследуемой культуры добавляют каплю 5 %–ного водного раствора фенола, активное движение в этом случае прекращается.2.) Темнопольная микроскопия нативных препаратов.3.) Световая микроскопия окрашенных красителями или металлами препаратов. Так как жгутики очень легко повреждаются при приготовлении препарата, в повседневной практике эти методы используется редко.

Для окраски жгутиков используют клетки, выращенные на скошенном агаре. Бактериальной петлей отбирают клетки, находящиеся у конденсационной воды и осторожно переносят в стерильную дистиллированную воду такой же температуры, что и температура инкубирования бактерий на скошенном агаре, а бактерии с петли не стряхивают, а осторожно погружают в воду. Пробирку с бактериями оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Используют химически чистое (вымытое в хромовой смеси) стекло, на которое наносят 2–3 капли суспензии. Суспензию распределяют по поверхности стекла, осторожно его наклоняя. Высушивают препарат на воздухе.

Жгутики очень тонкие, поэтому их можно обнаружить только при специальной обработке. Вначале при помощи протравки достигается разбухание и увеличение их размера, а затем производится окраска препарата, благодаря чему они становятся видимыми при световой микроскопии.

Чаще используют метод серебрения по Морозову:

– препарат фиксируют раствором ледяной уксусной кислоты 1 минуту, промывают водой;– наносят раствор танина (дубящий, делающий жгутики более плотными) на 1 мин, промывают водой;– обрабатывают препарат при подогревании импрегнирующим раствором азотнокислого серебра 1–2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

При микроскопии видны темно-коричневые клетки и более светлые жгутики.

4.) Электронная микроскопия препаратов, напылённых тяжелыми металлами. 5.) Косвенно — по характеру роста бактерий при посеве в полужидкий 0,3 %–ный агар. После инкубирования посевов в термостате в течение 1–2 сут отмечают характер роста бактерий: – у неподвижных бактерий (напр., S.Saprophyticus) наблюдается рост по ходу укола — «гвоздь», а среда прозрачна; – у подвижных бактерий (напр., Е.Cо1i)наблюдается рост в стороны от укола, по всему столбику агара — «ёлочка», и диффузное помутнение среды.

Определение подвижности микроорганизмов (на всякий случайJ):

1.) Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают её покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат под объективом 40, без иммерсионного масла, конденсор опущен. Вначале под объективом 8 находим край капли, а затем устанавливаем объектив 40 и исследуем препарат.2.) Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят каплю бактериальной культуры. Затем покровное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Под объективом 8 находим край капли, а затем устанавливают объектив 40 и исследуют препарат без иммерсионного масла, при опущенном конденсоре.