Постановка микрореакции преципитации

Качественную и количественную постановки микрореакции с испытуемой плазмой и инактивированной сывороткой крови следует осуществлять следующим образом.

При использовании качественной методики постановки микрореакции автоматической пипеткой забирают по 90 мкл плазмы или инактивированной сыворотки крови и вносят в лунки, куда затем добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую лунку вносят плазму или сыворотку крови от одного обследуемого и нумеруют соответственно списку в регистрационном журнале. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины во встряхивателе (100 качаний в 1 минуту) в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28 град.). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

При использовании количественной методики постановки микрореакции в 9 лунок горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл исследуемой плазмы или сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из нее в лунку 5-6 раз, затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей лунки 90 мкл переносят в четвертую и т. д. по десятую лунку, из которой 90 мкл удаляют. Таким образом получают двукратные разведения плазмы или сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до 1:516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки крови, т.е. исследуют цельную плазму или сыворотку крови. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 минут, после чего во все лунки добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют результаты так же, как при постановке качественной реакции.

Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или сыворотки крови, где обнаружен преципитат. Величина титра указывает на активность процесса, а его снижение во время лечения - на эффективность терапии. Стабильность титров настораживает клиницистов в отношении эффективности терапии, увеличение же их требует пересмотра лечения.

Для получения достоверных результатов следует пользоваться одной и той же серией препарата при обследовании больного в процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.

К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может наблюдаться долго после окончания лечения, в связи с чем эти тесты не могут служить критерием излеченности и больные снимаются с учета с положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.

Источники ошибок при постановке МР:

- неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток);

- исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных;

- неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием;

- бактериальное загрязнение эмульсии;

- нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии, растворов;

- замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;

- использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов.

Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.

Подсчет фагоцитарной активности нейтрофилов

Принцип.

Полиморфноядерные лейкоциты, моноциты периферической крови способны связывать на своей поверхности, поглощать и переваривать микробную тест-культуру.

Обычно используют стафилококк штамма 209. Однако он практически не подвергается внутриклеточному перевариванию и исключает прямое изучение этой функции фагоцитоза. Мы рекомендуем использовать штамм 9198.

Посуда и оборудование.

1. Химические пробирки.

2. Предметные стекла.

3. Шлифовальное предметное стекло.

4. Пипетки мерные.

5. Микроскоп.

6. Центрифуга.

Реактивы.

1. Метанол.

2. Красители: азур II, эозин.

3. Глицерин.

4. Среда 199.

5. Смесь донорских сывороток (2—3) AB(IV) группы.

6. Изотонический раствор хлорида натрия.

7. Набор стандартов для определения концентрации микробных тел по мутности.

8. Суточная культура Staphilococcus epidermidis шт. 9198.

Ход определения.

В стерильную пробирку с заранее внесенным раствором 0,6 мл гепарина (G. center), разведенного 1: 10, вносят 10 мл крови из кубитальной вены. Кровь тщательно перемешивают и центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Плазму вместе со слоем лейкоцитов осторожно отсасывают и помещают в чистую центрифужную пробирку, добавляя 5— 6 мл среды 199. Лейкоциты отмывают центрифугированием 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а находящиеся в осадке лейкоциты ресуспендируют в среде 199 дважды, каждый раз повторяя процедуру «мягкого» центрифугирования. После последнего центрифугирования пипеткой отсасывают надосадочную жидкость и часть клеточной взвеси, оставив в центрифужной пробирке 0,2 мл (10Х106 кл/мл) клеточной взвеси в среде 199. С косого агара с суточной культурой стафилококка стерильным изотоническим раствором натрия хлорида смывают колонии микробов. Используя стандарт оптической мутности, разводят микробную взвесь до концентрации 1 млрд. микробных клеток в 1 мл; 0,3 мл этой взвеси вносят в пробирку, содержащую 0,2 мл лейкоцитов в среде 199, и добавляют 0,15 мл пула свежих донорских сывороток AB(1V) группы (для опсонизации). Осторожным ротированием перемешивают компоненты и термостатируют 30 мин при 37 °С. По истечении указанного времени в пробирку добавляют 5 мл прогретого до 37 °С изотонического раствора натрия хлорида, встряхивают и центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость удаляют и делают мазки из лейкоцитарной взвеси, остатки которой вновь помещают в термостат при 37 °С для продолжения инкубации еще в течение 90 мин. Затем мазки приготавливают повторно из осадка двухчасовой инкубации.

Мазки готовят как обычно, на тщательно вымытых обезжиренных предметных стеклах. Каплю лейкоцитарной взвеси помещают недалеко от края стекла и шлифованным предметным стеклом, поставив его под углом 45° к поверхности впереди капли и подождав, пока капля равномерно распределится вдоль его ребра, легким быстрым движением проводят вперед, не отрывая от предметного стекла раньше, чем иссякнет вся капля.

Правильно сделанный мазок имеет равномерно матовый оттенок, не достигает краев стекла и заканчивается остроконечными язычками.

Приготовленные мазки сушат на воздухе, затем фиксируют 10 мин в абсолютном метиловом спирте и красят по Романовскому—Гимзе азур-эозином.

Состав готового красителя: азур II — 3 г, водорастворимый желтый эозин — 0,8 г, метиловый спирт — 250 мл и глицерин — 250 мл. Для окраски мазков берут 2 капли основного раствора красителя на 1 мл дистиллированной воды.

Можно готовить краску непосредственно перед окрашиванием мазков из азура II, эозина и дистиллированной воды в соотношении 3:2:5. На один мазок наслаивают 3 мл раствора красителя. Длительность окраски 45—50 мин.

После окрашивания мазки просматривают под микроскопом в иммерсионной системе (считают не менее 200 клеток) и производят расчет показателей фагоцитоза.

1. Фагоцитарный индекс (ФИ) — процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа.

2. Фагоцитарное число (ФЧ) — среднее число бактерий, находящихся внутриклеточно (частное от деления общего числа поглощенных бактерий на число клеток, вступивших в фагоцитоз).

3. Оба показателя рассчитывают на мазках, сделанных после 30- и 90-минутной (т. е. в общей сложности 120-минутной) инкубации, иными словами, речь идет о ФИЗО и ФИ120, соответственно ФЧЗО и ФЧ120.

4. Коэффициент фагоцитарного числа:

5. Индекс бактерицидности нейтрофилов:

где Чу — число убитых внутри фагоцитов микробов; Vn — общее число поглощенных фагоцитами микробов.

6. Опсонический индекс поглощения:

Нормальные величины:

· ФИЗО - 94,18±1,55%

· ФИ120 - 92,00 ± 2,52 %

· ФЧЗО - 11,29±1,00%

· ФЧ120 - 9,81±0,96%

· КФЧ - 1,16±0,04%;

· ИБН - 66,3±2,58%

Клиническое значение.

Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе диагностики иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующие гнойные воспалительные процессы, длительно не заживающие раны, склонность к послеоперационным осложнениям. Помогает в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией. В связи с тем что фагоциты участвуют в элиминации иммунных комплексов и активность фагоцитоза тесно связана с активностью компонентов комплемента, а именно Сз, концентрацией IgG антител, наличием других опсонирующих факторов, исследование фагоцитоза играет роль в диагностике, оценке активности и эффективности терапии при ревматических болезнях, коллагенозах.

Наиболее информативным для оценки фагоцитарной активности следует считать индекс поглощения, т. е. фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа, которые отражают завершенность фагоцитоза и индекс бактерицидности — способность фагоцита переваривать захваченный микроб. Особое значение в выявлении причин изменений фагоцитарной активности имеет определение опсонического индекса поглощения, так как он характеризует наличие сывороточных факторов, сопутствующих миокардитам, ревматизму, ревматоидному артриту и др., способных изменить активность иммунокомпетентных и фагоцитирующих клеток.