Процессы с участием нуклеиновых кислот: репликация, транскрипция.

Вся информация о строении и функционировании любого живого организма содержится в закодированном виде в его генетическом материале, основу которого составляет дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

ДНК большинства организмов — это длинная двухцепочечная полимерная молекула. Последовательность мономерных единиц (дезоксирибонуклеотидов) в одной ее цепи соответствует (комплементарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Принцип комплементарности обеспечивает идентичность новосинтезированных молекул ДНК, образующихся при их удвоении (репликации), исходным молекулам. Индивидуальными генетическими элементами со строго специфичной нуклеотидной последовательностью, кодирующими определенные продукты, являются гены. Одни из них кодируют белки, другие − только молекулы РНК.

Первые данные о химических свойствах ДНК появились в 1868 г. К началу 40-х годов XX в. было установлено, что молекула ДНК — это линейный полимер. Его мономерными единицами являются нуклеотиды, состоящие из азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и фосфатной группы. Фосфатная группа присоединена к 5'-атому углерода моносахаридного остатка, а органическое основание — к 1 '-атому. Основания в ДНК бывают двух типов: пуриновые [аденин (А) и гуанин (G)] и пиримидиновые [цитозин (С) и тимин (Т)]. В ДНК моносахарид представлен 2'-дезоксирибозой, содержащей только одну гидроксильную группу (ОН), а в РНК — рибозой, имеющей две гидроксильные группы. Нуклеотиды соединены друг с другом фосфодиэфирными связями, при этом фосфатная группа 5'-углеродного атома одного нуклеотида связана с З'-ОН-группой дезоксирибозы соседнего нуклеотида. На одном конце полинуклеотидной цепи находится З'-ОН-группа (З'-конец), а на другом — 5'-фосфатная группа (5'-конец).

В 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик, основываясь на данных рентгеноструктурного анализа кристаллов ДНК, пришли к выводу, что нативная ДНК (первичная структура) состоит из двух полимерных цепей, образующих двойную спираль. Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей (вторичная структура). При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин — с цитозином. Пара оснований А—Т стабилизируется двумя водородными связями, а пара G—С — тремя. Происходит дополнительная стабилизация за счет стэкинг-взаимодействия. Длина двухцепочечной ДНК обычно измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов (п.н.). Сахарофосфатный остов молекулы, который состоит из фосфатных групп и дезоксирибозных остатков, соединенных 5'— З'-фосфодиэфирными связями, образует как бы боковины винтовой лестницы, а пары оснований А—Т и G—С — ее ступеньки. Цепи молекулы ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 3'→5, другая 5'→3'.

Сприраль может быть право– и левозакрученной (повторяющееся звено не моно–, а динуклеотид). Существуют различные формы ДНК: В-форма (правозакрученная) ДНК с содержанием воды ≥40%, шаг спирали 3,4 нм, 10 п.о., h=0,34 нм. А-форма (правозакрученная), при содержании воды ≤30%, кристаллическая форма ДНК. Шаг спирали 2,86 нм, 11 п.о., h-=0,26 нм (между 2 азотистыми основаниями). Z-форма (левозакрученная) – зигзагообразная полинуклеотидная цепь. Считается, что переход ДНК из В в Z является одним их способов регуляции экспрессии генов. Суперспирали (надмолекулярные комплексы, третичная структура) в ДНК образуются в результате ферментативной реакции с участием топоизомеразы. Считается, что это напряженная структура, форма запасания энергии. Энергия используется в процессе репликации и транскрипции, когда расплетаются нити ДНК. Хромосома – кольцевая двухцепочечная ДНК, содержащая суперспиральные участки, образующие различные петли.

Носитель генетической информации должен удовлетворять двум основным требованиям: воспроизводиться (реплицироваться) с высокой точностью и детерминировать (кодировать) синтез белковых молекул. Модель ДНК Уотсона—Крика полностью отвечает этим требованиям. Во-первых, согласно принципу комплементарности, каждая цепь ДНК может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Следовательно, после одного раунда репликации образуются две дочерние молекулы, каждая из которых имеет такую же нуклеотидную последовательность, как исходная молекула ДНК. Во-вторых, нуклеотидная последовательность структурного гена однозначно задает аминокислотную последовательность кодируемого ею белка.

Репликация. Согласно модели Уотсона—Крика, каждая цепь ДНК служит матрицей при синтезе новой комплементарной цепи, а последовательность оснований в синтезируемой (растущей) цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы.

Этапы репликации: инициация, элонгация, терминация.

Хеликаза, топоизомераза и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК (стадия инициации), удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК (элонгация). Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку.

Каждая мономерная единица, присоединяющаяся к растущей цепи, находится в форме дезоксирибонуклеозид-5’-трифосфата. В ходе репликации β-и γ-фосфатные группы отщепляются в виде пирофосфата, а α-фосфатная группа связывается с 3’-ОН-группой последнего нуклеотида растущей цепи. Между α-фосфатной группой присоединяемого нуклеотида и 3-ОН-группой предыдущего нуклеотида растущей цепи образовалась фосфодиэфирная связь. К комплементарному спариванию готов следующий дезокси-рибонуклеозид-трифосфат.

Синтез ДНК как у про-, так и у эукариот осуществляется при участии множества разных ферментов. Основную роль играет ДНК-полимераза, которая последовательно присоединяет новые звенья к растущей полинуклеотидной цепи в соответствии с принципом комплиментарности катализирует образование фосфодиэфирных связей. У бактерий репликация ДНК начинается в особой точке молекулы, которая называется точкой начала (или сайтом инициации) репликации. В ДНК эукариот имеется несколько таких сайтов, и репликация может начинаться в каждом из них. Образующиеся при этом сегменты эукариотической ДНК сшиваются друг с другом с помощью особых ферментов. Кроме того, у эукариот есть специальный фермент теломераза, который достраивает концы (теломеры) хромосом. ДНК-полимераза способна наращивать ДНК только на 3’-конце. При синтезе новых копий одна нить удлиняется в направлении 3'→5, а другая 5'→3'. 5'-конец ДНК-полимераза наращивать не может, поэтому синтез одной цепи ДНК идет непрерывно, она называется моделирующей или ведущей, а синтез другой цепи осуществляется короткими фрагментами Оказаки, потом фрагменты Оказаки сшиваются и такая нить называется запаздывающей. Структура, образуемая во время репликации называется репликативной вилкой.

Основания в РНК бывают двух типов: пуриновые [аденин (А) и гуанин (G)] и пиримидиновые [цитозин (С) и урацил (У)]. В РНК моносахарид представлен рибозой, имеющей две гидроксильные группы.

Пары комплементарных оснований А—У, Г—У стабилизируется одной водородной связью, а пара G—С — тремя.

В расшифровке генетической информации, заложенной в ДНК, участвуют:

• Информационная РНК = матричная РНК(мРНК = иРНК)

• рибосомная РНК (рРНК)

• Транспортная РНК (тРНК)

В активно функционирующей клетке примерно 3–5% суммарной РНК приходится надолю мРНК, 90% - на долю рРНК и 4% – на долю тРНК.

м-РНК служит посредником при передаче информации, закодированной в ДНК к рибосомам, молекулярным машинам, синтезирующим белки живого организма. Кодирующая последовательность мРНК определяет последовательность аминокислот полипептидной цепи белка. Три последовательных нуклеотида (кодон) соответствуют одной аминокислоте.

М-РНК эукариот в отличие от прокариот содержит некодирующие участки (интроны), кроме того на 5’-конце имеется 7-метилгуанозиновый остаток, а на 3’-конце – полиаденилатная последовательность размером 50–400 пар оснований. К особенностям строения следует добавить инициирующий кодон (старт-кодон) АУГ и 2 терминирующих кодона. В клетках высших организмов существует спец. механизмы, которые распознают некодирующие участки, точно вырезают их и кодирующие участкисшивают в едниый линейный полинуклеотид м-РНК.

т-РНК одноцепочечная, содержитот 74 до 93 оснований. Обнаружено около 20 т-РНК, их число вцелом больше числа кодонов, поэтому существуют изоакцепторные т-РНК, которые отличаются по первичной структуре, но связывают одну и ту же аминокислоту. В составе т-РНК обнаружено около 50 минорных оснований, которые составляют 10-20% общего нуклеотидного состава. Примерно 60% азотистых оснований спарены за счет комплементарных взаимодействий. На 3’-конце находиться последовательность ЦЦА, к которой присоединяется активированная аминокислота. т-РНК образует вторичную и третичную структуры, которые имеют характерный вид клеверного листа. Функция т-РНК заключается в акцептировании той аминокислоты, которая закодирована в структуре антикодона. С помощью специфических ферментов (аминоацил-тРНК—синтетаз) к 3'-концу тРНК присоединяется соответствующая аминокислота.

р-РНК составляет около половины состава рибосом. Существенная часть структуры р-РНК представлена двухспиральными участками. мРНК может быть представлена десятками различных типов молекул, а рРНК — всего двумя типами. Более крупная рРНК образует с белками рибонуклеопротеидный комплекс, называемый большой рибосомной субъединицей, а рРНК меньшего размера — комплекс, называемый малой рибосомной субъединицей. Во время синтеза белков субъединицы объединяются с образованием рибосо­мы. У эукариот обе рибосомные субъединицы крупнее, чем у прокариот.

Элементы вторичной структуры РНК — стебель-петли, петли, псевдоузлы, двухцепочечные участки РНК (шпильки).

Транскрипция.

Транскрипция во многом сходна с репликацией. Матрицей при синтезе РНК служит определенный участок одной из цепей ДНК. РНК-полимераза копирует этот участок, последовательно соединяя друг с другом с помощью 3'—5'-фосфодиэфирных связей рибонуклеотиды в соответствии с правилом комплементарности. В ходе транскрипции новосинтезированная молекула РНК отсоединяется от ДНК, и двойная спираль ДНК восстанавливается. Чтобы обеспечить транскрипцию только отдельных сегментов ДНК, должны существовать некие сигнальные последовательности, указывающие, где начинается (инициируется) транскрипция и где она останавливается (терминируется). Сигнал инициации обычно располагается перед кодирующей последовательностью, а сигнал терминации — вслед за ней. Участок ДНК, предшествующий транскрибируемому гену, называется 5'-фланкирующей последовательностью, а расположенный за ним — З'-фланкирующей.

С молекулярной точки зрения ген представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, транскрибируемую в РНК. Подавляющее большинство транскрибируемых последовательностей ДНК составляют так называемые структурные гены, на которых синте­зируются мРНК. Конечным продуктом структурного гена является белок. У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК. Транскрипция начинается со связывания РНК-полимеразы с промотором, и далее последовательно копируется весь структурный ген (кодирующая область) от первого нуклеотида до последнего с образованием функциональной мРНК. У эукариот большинство структурных генов состоит из нескольких дискретных кодирующих областей (экзонов), разделенных некодирующими областями (интронами). По завершении транскрипции эукариотического структурного гена интроны вырезаются из первичного продукта транскрипции с помощью ферментов, а экзоны сшиваются друг с другом «торец в торец» (сплайсинг) с образованием функциональной мРНК. Обычно длина экзонов составляет от 150 до 200 нуклеотидов, а длина интронов варьирует от 40 до 10000 нуклеотидов. Очень немногие эукариотические структурные гены вообще не имеют интронов. Иногда сплайсинг мРНК может проходить по альтернативному варианту. Например, в одной ткани функциональная мРНК может образовываться в результате соединения всех экзонов первичного транскрипта, а в другой какой-то экзон будет вырезан вместе с фланкирующими его интронами и образуется другая функциональная мРНК. Благодаря аль­тернативному сплайсингу в разных тканях могут образовываться разные продукты одного и того же структурного гена

прокариоты эукариоты

Белки — это биологические молекулы, участвующие практически во всех процессах, протекающих в живых системах. Они служат катализаторами разнообразных биохимических реакций, осуществляют транспорт веществ внутри клеток и между клетками, регулируют про­ницаемость клеточных мембран, из них строятся различные структурные элементы. Белки участвуют в осуществлении двигательных функций, обеспечивают защиту от инфекций и токсинов, регулируют синтез остальных генных продуктов. Основной структурной единицей белков являются аминокислоты. Все аминокислоты имеют сходное химическое строение. К центральному атому углерода (с-углерод) присоединены атом водорода (Н), аминогруппа (NH₃⁺), карбоксильная группа (СОО~) и R-гpyппа (боковая цепь). Существует 20 разных боковых групп и соответственно 20 аминокислот. Соединяясь друг с другом пептидными связями, аминокислоты образуют полипептидную цепь. Пептидная связь образуется между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. Первая аминокислота белковой молекулы имеет свободную аминогруппу (N-конец), а последняя — свободную карбоксильную группу (С-конец).

Окончательной структурной классификации белков нет. Различают: периферические и интегральные, гидрофобные и гидрофильные, сложные и простые белки.

К сложным белкам относятся:

1. Металлопротеиды (ферредоксин, сериновые протеиназы, амилазы);
2. Фосфопротеины (казеин)
3. гликопротеины
4. хромопротеиды (содержат окрашенные простетические группы)
5. липопротеиды
6. нуклеопротеиды (гистоны)

Белки можно разделить по функциям:

1. ферменты
2. гормоны
3. защитные (вещества белковой природы которые помогают организму преодолевать патологические состояния или бороться с возбудителями заболеваний – интерфероны, факторы свертывания крови)
4. транспортные (цитохромС, гемоглобин, миоглобин, альбумин)
5. структурные (составляют структкрный остов многих тканей и органов – коллаген, эластин,керотин)
6. двигательные (актомиозиновый комплекс)
7. запасные (ферритин)
8. токсины (токсин ботулизма)

Уровни структурной организации белков:

• первичная
• вторичная(α- и β-спираль)
• третичная(глобулы и фибриллы)
• доменная(домен-структурно обособленный участок полипептидной цепи)
• четвертичная(укладка нескольких отдельных полипептидных цепей в пространстве).

Трансляция.

Этапы: инициация, элонгация, терминация.

Инициация

ž 1.Активация инициаторной аминокислоты (метионин) при участии ферментов связывается с АТФ. Образуются аминоациладенилат

ž 2. Соединение аминоациладенилата с тРНК (с помощью аминоацил-тРНК-синтетазы) Образуется комплекс АМИНОАЦИЛ-тРНК.

ž 3. Перенос комплекса АМИНОАЦИЛ-тРНК на малую рибосомную субъединицу.

ž 4. Спаривание Антикодона тРНК со старт-кодоном мРНК (триплет AUG). Образуется комплекс аминоацил-т-РНК-м-РНК. Происходит по разному у про- и эукариот.

ž 5. Присоединение к комплексу большой рибосомной субъединицы и образование инициаторного комплекса.

Элонгация Процесс элонгации включает образование пептидных связей между соседними аминокислотами, при этом очередность присоединяемых аминокислот определяется очередностью кодонов в мРНК. После образования инициаторного комплекса кодон в молекуле мРНК, следующий за кодоном AUG, спаривается с комплементарным ему антикодо-ном соответствующей тРНК, определяя таким об­разом, какая из нагруженных тРНК присоединится к рибосоме (ненагруженные тРНК не связываются с рибосомами). Если вторым триплетом в мРНК оказывается CUG, то следующей к рибосомному комплексу присоединяется несущая лейцин тРНК с антикодоном 3'-GAC-5'. Когда эта тРНК оказывается на месте, между карбок­сильной группой метионина и аминогруппой лейцина с помощью ферментативной активности, присущей большой субъединице, образуется пептидная связь, при этом лейцин остается связан­ным со своей тРНК, а метионин отсоединяется от инициаторной тРНК, и последняя отделяется от рибосомы. Комплекс метионин—лейцин— тРНК~мРНК «протягивается» через рибосому (транслокация), так что следующий кодон мРНК может связаться с нагруженной тРНК, несущей соответствующий антикодон. Если третьим кодоном мРНК является UUU, то следующей аминокисло­той в растущей полипептидной цепи будет фенил-аланин; его доставит к рибосоме тРНК с антикодоном AAA. Когда эта тРНК окажется на месте, между карбоксильной группой лейцина и аминогруппой фенилаланина образуется пептидная связь. тРНК¹^¹¹ отделится от рибосомы, произойдет транслокация пептидил-тРНК^РЬе (тРНК с присоединенной к ней растущей полипептидной цепью), и следующий кодон мРНК сможет связаться с антикодоном соответствующей нагруженной тРНК. Эти события — связывание нагруженной тРНК с мРНК благодаря комплементарному спариванию кодона с антикодоном, образование пептид­ной связи, отсоединение «разгруженной» тРНК, транслокация — продолжаются до тех пор, пока не соединятся друг с другом все аминокислоты, зако­дированные в мРНК. Элонгация продолжается до тех пор, пока рибо­сома не дойдет до кодона UAA, UAG или UGA (стоп-кодон, терминирующий кодон)

Терминация

• стоп-кодоны (триплеты UAA, UAG или UGA) прекращают процесс элонгации

• Присоединение к рибосоме белкового фактора освобождения (распознает стоп-кодон)

• гидролиз (разрушение) связей между последней тРНК, полипептидом и мРНК

• Распад рибосомы на субъединицы